[发明专利]一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法

说明书

技术领域：

本发明是涉及一种筛选低富集镉花生品种的方法，具体是涉及一 种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法。

背景技术：

花生是世界四大油料作物之一，也是我国单产、总产最高的油料 作物和经济作物，种植面积超过500万公顷，其产量占油料作物总产 量的1/2，占世界花生总产量的45％，已达1450万吨以上。多年来， 花生一直是我国出口创汇额最高的油料作物。目前，我国花生生产面 临的主要挑战是黄曲霉毒素污染、农药残留(主要是丁酰肼污染)和籽 粒镉(Cd)含量偏高等问题。Cd以其高毒性、高生物迁移性而备受关 注。据2003年我国北方产区花生普查结果显示，花生Cd含量平均为 0.2～0.3mg/kg，其中山东产区花生Cd含量一般在0.2mg/kg以下， 而山东以北地区花生Cd含量多在0.2mg/kg以上。在广西进行市场抽 检发现，花生籽粒Cd含量范围为0.07～0.79mg/kg，平均0.21mg/kg。 市场上的花生Cd含量水平基本符合国家新近颁布的0.5mg/kg限量标 准(GB2762-2005)，但多数超过国家无公害食品Cd含量要求 (Cd≤0.05mg/kg)，半数以上高于WAO/WHO规定的限量标准 (Cd≤0.1mg/kg)，甚至达不到《国际卫生法典》规定的0.2mg/kg的 花生Cd限量标准，已威胁到食品安全和人体健康，控制和降低花生 籽仁镉污染亟待解决。

针对当前花生田土壤以及籽仁中重金属镉污染的日益严重的现 状，国内外开展了大量有关花生镉低积累品种筛选和农艺栽培技术研 究。土壤中能够被植物所吸收的镉(有效态镉)是影响花生镉吸收与 积累的重要因素。因此，通过农艺栽培技术措施降低花生田土壤有效 态镉含量来降低花生镉积累是有其理论基础的，比如施用石灰提高土 壤的PH，降低花生田土壤有效态镉含量，但该技术也存在极大弊端， 在土壤PH提高的同时，土壤中有效态铁、锌、锰、铜镍等金属矿质 营养元素含量下降，影响花生生长和产量。花生镉积累存在极显著的 品种间差异是花生镉低积累品种筛选的本质和基础。然常规的筛选方 法有通过盆栽镉处理收获花生饱果，进行原子吸收测定籽仁镉含量和 测定不同花生品种对镉胁迫生理响应的差异来进行筛选，但品种繁 多，生长周期长，操作繁琐，成本高，分析处理烦等问题。

发明内容：

本发明的目的是提供一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生 品种的方法，它利用营养液培养花生幼苗，利用幼苗叶片AhMT2a基 因序列，应用荧光定量PCR技术检测该基因表达差异的方法进行镉敏 感品种的筛选；检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好， 且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是是采用以下技术方案：1、 利用营养液培养花生幼苗：花生种子先经75％乙醇处理1分钟，再用 0.1％的氯化汞进行消毒处理15分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍 备用。恒温箱25℃浸种12h，将吸胀后的种子，摆放于小的塑料盆中 的尼龙网上，每盆20粒，用含Cd²⁺(CdCl₂·2.5H₂O溶液)的Hongland 营养液在25℃室温无菌培养室下培养，每天光照14小时。试验采用完 全随机排列，对照用无Cd²⁺的Hongland营养液培养。每两天换一次营 养液。花生营养液培养6天后，幼苗长出第一真叶，随机取不同镉处 理水平幼苗，提取RNA，重复3次，反转录为cDNA，以其为模板进行罗 氏荧光定量PCR分析。

2、设计特定的不同镉处理水平：对照、低镉处理水平10μM和 高镉处理水平200μM。

3、花生AhMT2a基因表达差异检测与分析方法：依据荧光定量PCR 引物设计原则对基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参 基因对同一样品cDNA模板利用Roche荧光定量PCR仪进行定量分析。引 物设计如下：

AhMT2a-F：5’-GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3’

AhMT2a-R：5’-CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3’

Actin-F：5’-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3’

Actin-R：5’-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3’