[发明专利]一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法及试剂盒

权利要求书

1.本发明为一种单纯疱疹病毒(HSV)基因分型检测方法及试剂盒，其特征在于，采用基于HSV DNA聚合酶基因(Pol)设计的引物探针，利用TaqMan探针多波长荧光PCR技术在单管中同时扩增检测单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，对HSV进行基因分型。

2.如权利要求1所述，其特征在于，所用HSV基因分型检测方法与试剂盒引物探针根据HSV Pol基因序列设计，一对引物扩增HSV-1和HSV-2型共有靶序列SEQ ID No.1上连续70～300个核苷酸序列，两条TaqMan荧光探针分别检测HSV-1和HSV-2DNA，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。

3.如权利要求2所述，其特征在于，试剂盒所用的引物序列可以为SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的序列；HSV-1荧光探针可以为SEQ ID No.4序列，其5’端标记FAM荧光基团；HSV-2荧光探针可以为SEQ ID No.5序列，其5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团；两条探针3’端标记的淬灭基团BHQ。引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列；其中引物序列也可以是按照靶序列SEQ ID No.1向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列。

4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针和内参DNA。

5.如权利要求4所述，其特征在于，HSV基因分型检测方法与试剂盒所用的内参探针采用SEQ ID No.5序列，探针5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团，3’端标记TAMRA或BHQ淬灭基团；内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

6.如权利要求4所述，所用的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(HSV-1和HSV-2DNA)扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游位置。

7.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照。

8.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2～0.4mM、MgCl₂2.5～5mM、引物各0.2～0.5μM、HSV-1和HSV-2荧光探针及内参探针各0.1～0.5μM、Taq DNA聚合酶1～5U、UNG酶0.1～1U。

9.如权利要求1所述试剂盒在HSV基因分型检测中的应用，包括以下步骤：

(1)样本处理提取模板DNA，样本为疱疹感染病变部位渗出液或分泌物。

(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上三个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中HSV的存在和基因型别。