[发明专利]一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

各种外伤和脑外科术后造成的颅骨缺损是临床常见疾病，当缺损面积大于颅骨面积的十分之一后，即不能通过自体周围骨组织再生修复缺损。目前常用的治疗手段均有其自身无法弥补的缺点，不能达到外形和功能的良好修复，采用组织工程技术有望达到理想的修复效果。

脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stemcells，UCB-MSCs)是存在于脐带血中的一种间充质干细胞，具有潜在的多向分化能力，在体外特定诱导环境下，除了可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化之外，还可以分化为神经胶质细胞、肝细胞、心肌细胞等。尽管UCB-MSCs的成骨分化潜能已被证实，但其在骨组织构建及骨缺损修复领域的研究却很少。国外的研究多集中在神经系统、血管内皮细胞、心肌细胞、造血细胞等方面；而以UCB-MSCs为种子细胞构建组织工程骨的研究，目前尚未见报道。其最重要的原因在于：尚无获得比较纯化的具有成骨分化潜能的UCB-MSCs细胞亚群的方法。事实上，采用目前常用的分离方法获得的UCB-MSCs，是一个混合细胞群体，不可避免地含有大量混杂的、不具备成骨分化潜能的细胞，例如脂肪前体细胞、内皮细胞、血管周皮细胞、造血细胞等。必须对这些混杂的细胞群体进行分选纯化，才能提高UCB-MSCs作为种子细胞构建组织工程骨的成功率和均质性。

因此，本领域迫切需要提供一种分离得到纯化的具有成骨潜能的UCB-MSCs。

发明内容

本发明旨在提供一种脐带血间充质干细胞的分离方法。

本发明的第二个目的是提供一种纯化的具有成骨潜能的脐带血间充质干细胞。

本发明的第三个目的是提供一种上述纯化的脐带血间充质干细胞的用途。

本发明的第四个目的是提供一种组织工程化骨移植物。

本发明的第五个目的是提供一种上述的组织工程化骨移植物的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种脐带血间充质干细胞的分离方法，所述的方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；和

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞。

在另一优选例中，步骤(1)中避光混合20-40分钟。

在另一优选例中，步骤(1)中4℃避光孵育20-40分钟，其中每隔10分钟进行颠倒震荡操作，以避免发生细胞沉淀，有利于与抗体充分反应。

在另一优选例中，每5.0×10⁶细胞经避光孵育20-40分钟，分选后可获得1.0-1.3×10⁶数量的CD105阳性的细胞。

在另一优选例中，所述来自脐血的间充质干细胞选自第1、4、7、和/或10代细胞。

在另一优选例中，所述的来自脐血的间充质干细胞通过下述步骤得到：

(a)将脐血和淋巴细胞分离液混合、离心，得到白膜层细胞；和

(b)培养白膜层细胞，得到来自脐血的间充质干细胞。

在另一优选例中，步骤(b)中白膜层细胞培养在含有DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素、和L-谷氨酰胺的培养液中进行。

在另一优选例中，DMEM培养液(1000-4500mg葡萄糖/升)的胎牛血清含量为15-30％(v/v)，并且培养皿在接种细胞24小时前预先使用胎牛血清涂层处理(Coating)。

在另一优选例中，DMEM为低糖的培养液(1000mg葡萄糖/升)，胎牛血清的含量为20％(v/v)。

在另一优选例中，所述的脐带血是人脐带血。

在本发明的第二方面，提供了一种脐带血间充质干细胞，所述的干细胞通过如上所述的本发明提供的分离方法得到，所述的脐带血间充质干细胞为CD105阳性(CD105⁺)。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的脐带血间充质干细胞的用途，(i)用作组织工程种子细胞；和/或(ii)用于制备组织工程化骨移植物。

在本发明的第四方面，提供了一种组织工程化骨移植物，所述的移植物包括如上所述的本发明提供的脐带血间充质干细胞和医学上可接受的生物可降解材料。

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程化骨移植物的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；