[发明专利]组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及软骨仿生细胞外基质，特别涉及一种组织工程用仿生软骨细胞 外基质的制备方法。

背景技术

由创伤或骨病所致关节部位软骨缺损临床常见，严重影响患者生活质量， 已成为目前肢体残障的主要原因之一。美国发病率为1.5‰～3‰，我国约为美 国的5～6倍，且呈逐年上升趋势。关节软骨属于透明软骨，缺乏神经血管营养， 损伤后自身难以修复。临床现有治疗措施均存在明显缺陷，其保守治疗和关节 清理术只能暂时缓解疼痛，不能阻止病程的发展；自体骨软骨移植术可造成供 区损伤，且来源有限，难以修复较大面积的缺损；异体骨软骨移植术存在免疫 排斥反应及传播疾病的可能；人工关节置换术则费用昂贵、并发症较多、翻修 率较高，特别是对年轻患者的身心影响大、经济负担重。

组织工程学的诞生及其快速发展为关节软骨的再生修复提供了新技术。20 世纪80年代随着细胞生物学与工程材料学等基础学科的深入发展，组织工程学 的研究经历了两个阶段：前10年主要是证实利用细胞和生物材料构建组织的可 行性；后10多年则在研究内容、手段、技术改进和临床试用等方面不断深入， 为提高疗效和拓展组织工程产品作准备。1987年瑞典学者报道移植体外扩增软 骨细胞来临床治疗自体关节软骨缺损。1997年美国食品药品管理局FDA批准 Genzyme公司的组织工程产品Carticel进入临床，到目前已超过4000名患者 受益于该产品。2004年中国武警总医院将德国Verigen公司构建的组织工程软 骨应用于临床，但我国目前还缺乏具有自主知识产权的组织工程软骨基质材料 应用于临床。

组织工程支架材料为构建组织的细胞提供的三维支架，有利于细胞的黏附、 增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。在组织工程中，支架材料起到 细胞外基质的作用，是对细胞外基质的结构和功能的仿生。它不仅起支撑作用， 保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分 化和增殖的场所，从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。

研究表明，正常关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，两者协调配合， 保证了关节软骨的正常生理功能。软骨细胞占整个组织体积的5％，主要功能为 分泌胞外基质，保持基质的更新。细胞外基质70％由水构成，其余由胶原和蛋 白多糖组成，主要负责承载软骨细胞，调节细胞的增殖和分化，缓冲关节应力。 胶原占软骨干重的60％-80％，其中95％为II型胶原。蛋白多糖聚合物占透明软骨 干重的20％-40％，主要包括硫酸软骨素和透明质酸，两者结合形成蛋白多糖聚 合物。聚合物中的氨基葡聚糖残基带有负电荷，分子间相互排斥，具有强烈的 亲水性，这是软骨基质保持大量水分的重要原因。硫酸软骨素和胶原纤维之间 的键连接，避免了基质过度水化，进而防止软骨软化。现有技术制备的组织工 程软骨支架材料与正常的软骨基质无论在成分上还是结构上，都存在显著的差 异。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法， 能够制得与正常软骨结构和成分类似的，仿生度高的组织工程用仿生软骨细胞 外基质，并且该组织工程用仿生软骨细胞外基质具有良好的生物相容性、可降 解吸收性以及机械特性，同时成本低廉，成为修复软骨缺损的理想生物材料并 满足临床大量应用的需要。

本发明的组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法：包括以下步骤：

a.选取制备组织工程用仿生软骨细胞外基质的仿生原材料，所述仿生原材料按 质量百分比(wt％)包含如下成分：60～80的II型胶原蛋白、15～30的硫酸 软骨素和5～10的透明质酸；

b.将步骤a中选用的仿生原材料用浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的有机酸或 浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的盐酸充分溶解后得到酸性溶液；

c.将步骤b中得到的酸性溶液依次通过制孔处理、固化处理和强化处理并得到 所需的适合软骨种子细胞生物学行为要求的组织工程用仿生软骨细胞外基 质。

进一步，步骤c中得到的组织工程用仿生软骨细胞外基质具备如下物理结 构参数：孔径100-150μm，孔隙率60-90％，孔通率100％；

进一步，步骤b中所述的有机酸为醋酸或丙二酸；