[发明专利]一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高分子尿激酶层析介质及制备方法，尤其涉及一种特异性 纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用。

背景技术

根据市场调研机构Datamonitor公司预测，到2015年，全球新颖抗血栓 药物创造的市场总价值将达到100亿美元左右。其中血栓溶解剂纤溶酶原激活 剂(PAs)类的药物就达15亿美元。而主要的纤溶酶原激活剂包括链激酶 (Streptokinase)、尿激酶(Urokinase)、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA) 等。随着世界人口老龄化的进程，对这类药物的需求必然进一步增加。作为溶 栓类药物中的一种，尿激酶是可直接促使无活性的纤溶酶原变为有活性的纤溶 酶，使组成血栓的纤维蛋白水解。临床上用于脑血栓形成、脑栓塞、周围动脉 或静脉血栓症、肺栓塞、急性心肌梗死等。也可用于眼科溶解眼前房的血纤维、 血块。因此在临床上用途广泛。

尿激酶是人体肾细胞产生的一种碱性蛋白酶，会因人体代谢而随尿液排 出，因此人尿是生产尿激酶的最主要来源之一。尿激酶在体内合成时为一分子 量为55kD的单链多肽酶原，称为单链尿激酶(sc-uPA)。在人体尿液中，尿 胃蛋白酶可把尿激酶原切割为双链形式具有高生物活性的天然尿激酶分子，其 分子量为54700D。天然尿激酶分子双链通过二硫键连接，称为双链尿激酶(tc- uPA)，也称为高分子尿激酶(HUK)。受到各种酶的切割作用，高分子尿激酶会 进一步降解为分子量为31300D的低分子尿激酶(LUK)。在溶栓药物的应用中， 虽然LUK具有一定的体外溶栓生物活性，但由于缺少N-端的两个重要模块(生 长因子样模块G和Kringle模块K)，在体内的溶栓作用机制不明确，可能会引 起溶血等严重副反应，而且高分子尿激酶在体内的半衰期较长，因此药用的尿 激酶制剂产品对高分子尿激酶含量有明确规定。其中美国FDA及欧州药典EP 明确规定在尿激酶制剂中，高分子尿激酶的含量必须大于90％。我国药典2005 版规定，高分子尿激酶含量不低于90％，而实际上国际原料药市场对高分子尿 激酶含量的要求更高。因此，从生产工艺的角度来说，高分子尿激酶的收率和 纯度是评价工艺优异的重要指标。

我国是一个人口大国，生产尿激酶的原材料丰富，但由于缺乏较有效的 分离纯化方法，国内对于尿激酶的生产大多局限于粗品，难以精制到高纯度的 高分子尿激酶制剂。因此研究特异性强，纯化效果好，酶活性回收率高的尿激 酶纯化方法具有显著的经济价值。国内外有不少学者在亲和配位体和纯化介质 方面进行了尝试，如研究单克隆抗体亲和层析(李秀珍等，军事医学科学院院 刊，1988，12(3)：195-198)，筛选和开发对尿激酶催化活性域具有高亲和性 的系列新颖配位体(李荣秀等，专利号ZL 99124231.9)，开发联苯胺-琼脂糖 亲和层析(郑光会等，专利号91100702.4)，开发对氨基苯甲脒-sepharose 6B 亲和层析(司世麟等，河北科学院学报，1991，4：41-46；陈祥胜等，湖北中 医学院学报，2008，10(4)：30-31)，研究头孢唑啉-Sepharose 4B亲和层析 介质(曹学君等，生物化学与生物物理学报，1998，30(6)：635-637)，以及 开发基于胍基和氨基苯甲脒的磁性亲和层析介质(董聿生等，高等学校化学学 报，2002，23(6)：1013-1017；董聿生等，色谱，2001，19(1)：20-24)等。 上述对尿激酶纯化介质及工艺的改进和探索只注重了尿激酶生物活性的最终 回收率和纯化倍数，却难以有效分离高分子尿激酶和低分子尿激酶，因此实际 效果有限。其主要原因是传统亲和层析都是基于尿激酶分子的β链C-端丝氨酸 蛋白酶催化活性域活性位点(His204，Asp255和Ser356)组成的“口袋”高 级结构，而高分子尿激酶和低分子尿激酶都具有此天然高级结构，因此单纯用 亲和层析往往难以达到分离高分子尿激酶和低分子尿激酶的要求，还需要借助 于凝胶过滤层析等步骤进行进一步分离，费时费力并且尿激酶活力损失。而且 人尿蛋白中含有许多具有相似“口袋”结构的蛋白或酶类，如胰蛋白酶和尿胰 激肽释放酶等，一般亲和层析对这些生化分子也缺少分辨力。因此，本发明的 目的是获得一种适用于高效分离高分子尿激酶和低分子尿激酶的介质并用于 高纯度高分子尿激酶的大规模生产。

发明内容