[发明专利]一种用于高GC含量基因的PCR扩增体系及扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种适用于高GC含量基因的PCR 扩增体系及扩增方法。

背景技术

PCR(Polymerase Chain Reaction)全称聚合酶链式反应，是广泛用于诊断 学、分子生物学、微生物学、遗传学的一项特定DNA体外扩增技术。虽然1988 年以来人们用基本的PCR程序已经成功扩增出了大量的基因片段，但是非特异 性的结果和耗时的过程也开始渐渐无法满足更加广泛的需求。特别是面对具有 特殊二级结构的高GC含量基因，包括一些引物、增强子和其他控制元件，人 们往往束手无策。于是多年来，人们对常规的PCR程序做了很多的改进，也尝 试了很多可以提高产物特异性的方法，包括热启动、两步PCR、slowdown PCR 和某些添加剂的应用等。

热启动是用95℃先使具有复杂二级结构的模板DNA充分变性，再加入Taq 酶，这样做可以避免操作过程中产生非特异性序列的扩增，并将DNA聚合酶与 其他反应物隔绝，避免在未达到设定温度前就开始反应。

slowdown PCR是Ulrich H Frey等人于2003年首次报道的，它通过在PCR 的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约 10℃的退火温度下开始，然后每三个循环降低1℃，直到退火温度低于Tm 5℃。 这样，特异性最高的目的片段会被优先扩增，正确和非正确退火温度之间的任 何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异(每摄氏度造成4倍差异)。因 此，相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集，并在随后的循环中继续扩 增占据优势。与此同时，这种程序降低了先前报道的Touchdown PCR扩增过程 中升温降温的速率，变性到退火的降温速率从5℃/s降低至1.5℃/s，同时从退 火到延伸的升温速率从5℃/s降低至2.5℃/s，使得引物和模板能充分的结合， 同时减少二级结构的形成，从而PCR扩增能顺利进行。

近年来，越来越多的可以提高PCR效率和产物特异性的添加剂被发现，包 括二甲亚砜、甲酰胺、甜菜碱、7-Deaza-dGTP、甘油、聚乙二醇和dUTP等。 在这些添加剂中，虽然7-Deaza-dGTP报道较多，但是其价格昂贵且不易获得。 然而，二甲亚砜、甘油和甜菜碱等添加剂就更为实用。其中，甲亚砜的作用是 减弱模板DNA的二级结构的影响，便于DNA酶延伸，减少非特异性条带，同 时改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但 是当浓度高(大于10％)时会降低其保真性。同时，二甲亚砜作为有机溶剂， 能破坏DNA聚合酶结合的水化膜，使得DNA聚合酶变性。甘油为多羟基的醇， 可以为DNA聚合酶提供羟基，使DNA聚合酶保持较高的活性保护DNA聚合酶， 从而提高产量，增加酶的稳定性。另外，甜菜碱全名三甲基甘氨酸，它可以通 过与DNA大沟中的AT对结合而影响延伸反应，或者通过与DNA小沟结合， 增加GC对的水化程度，降低双螺旋DNA的稳定，使二级结构易于打开，从而 使得引物能与模板充分结合，保证扩增的顺利进行。

虽然上述方法和手段的单独使用都获得了一定的效果，但是对于引物和模 板的要求普遍过于苛刻，适用范围也较为局限，所以在这些基础上的改进显得 极其迫切且具有重大应用价值。

发明内容

本发明目的是提供一种用于高GC含量基因的PCR扩增体系。

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种用于高GC含量基因的高 效PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括：DNA聚合酶、MgCl₂、dNTP、上 游引物、下游引物、DNA模板、二次蒸馏水；所述PCR扩增体系还包括：三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH7.8)，二硫苏糖醇，牛血清白蛋白和添加 剂；

所述添加剂选自：甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、正丙砜、二乙砜、 甲基磺酰甲烷、二甲亚砜、2，4-二甲基噻吩烷、3-环丁烯砜、甜菜碱、1，5，6-三 氢-2-甲基-4-羧基嘧啶、1，6-二氢-2-甲基-4-羧基-5羟基嘧啶、1，4，5，6-四氢-2-甲 基-嘧啶或4，5，6，7-四氢-2-甲基-1氢-1，3-二氮杂卓-4-羧酸中的一种或一种以上的 混合物；