[发明专利]猪血液作为生物样品预警克伦特罗残留的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学和农业技术领域，涉及动物食品中药物残留的方法，尤其涉及 猪血液作为生物样品预警克伦特罗残留的方法。

背景技术

克伦特罗(clenbuterol)是一种人工合成β-肾上腺素受体激动剂类药物，商品名称为平 喘素，俗称瘦肉精，本用于治疗哮喘等疾病，在发现它能显著具有促进生长和提高动物 瘦肉率的作用之后，曾一度作为饲料添加剂广泛应用畜牧业。但克伦特罗毒性大，易在 动物组织中蓄积，从而引发了一系列的中毒事件。因此，为确保畜禽产品安全，我国于 1997年禁止克伦特罗在动物生产中使用。但是受经济利益的驱使，克伦特罗的使用屡禁 不止，一个很重要的原因就是监管手段落后。目前，监控克伦特罗用的靶组织主要有动 物可食组织和动物尿液等。由于血液相对尿液中克伦特罗含量相对较低的原因，血液中 克伦特罗的监控一直未能引起重视，而实际上猪血液样品对于兽医部门来说是最容易获 得的样品，也是覆盖面最全的样品。

中国专利申请[申请号为：CN02131321]，名称为“一种免疫层析一步法检测β-肾上 腺素激动剂类药物的方法及试纸的制备”，其关键技术主要包括待检样品的预处理方 法、硝酸纤维素膜的制备方法、胶体金结合物的制备方法、胶体金结合物垫的制备及试 纸条的组装方法等。其检测原理是样品中β-兴奋剂类药物和胶体金结合垫上的限量的胶 体金标记抗β-兴奋剂类药物抗体结合，多余的胶体金标记抗β-兴奋剂类药物抗体再和硝 酸纤维素膜上的β-兴奋剂类药物反应，达到简便、快速、单份筛查β-兴奋剂类药的一种 或多种之目的。但该技术仍采用的是传统的胶体金免疫层析技术，检测时间长，可达20 多分钟，检测限还不能达到0.3ppb(μg/L)，且检测的特异性不够强。当前已申请的专 利中用胶体金免疫试纸条检测盐酸克伦特罗的最低检测下限一般在0.09ppb(ng/ml)以 上，因而还不能达到快速、超微量检测的需要，并且结果的判定较为困难。

随着分析技术的发展，对于血液中低含量的克伦特罗分析已成为可能。目前筛选方 法中酶联免疫分析技术(ELISA)的灵敏度通常均能达到0.1μg/L；确证方法中气相色谱 质谱联用(GC/MS)技术和液相色谱串联质谱技术(HPLC/MS/MS)的灵敏度通常也能 达到0.5μg/L以下。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供为了更好地监控克伦特 罗在生猪生产中的使用，利用猪血液作为生物样品分析克伦特罗含量，同时根据猪尿液 和血液中两者的相关性从而推出尿液中的克伦特罗含量，使其不仅覆盖面最广，又容易 获得的生物样品用于监控克伦特罗的违禁使用，克服现有监控生猪中违禁使用克伦特罗 生物样品的不足的猪血液作为生物样品预警克伦特罗残留的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：猪血液作为生物样品预警克伦特罗 残留的方法，步骤一是将生猪饲喂盐酸克伦特罗，同时采集生猪的尿液和血液；步骤二 是取步骤一中一定量生猪的尿液和血液的样品并加入无水碳酸钠溶液后进行有机溶剂 提取，在提取后加入稀盐酸反萃取，反萃取液直接阳离子小柱后，用氨化甲醇洗脱，洗 脱液吹干后经硅烷化试剂衍生，最后进行气相色谱质谱分析；步骤三是把步骤二所得的 尿液和血液中的克伦特罗含量进行相关性分析，并建立线性方程。

采取的措施还包括：

在上述的猪血液作为生物样品预警克伦特罗残留的方法中，所述的步骤一为在给生 猪喂盐酸克伦特罗后并距初次喂药时间为0d、0.25d、1d、1.25d、2d、5d、7d、10d、 15d时分别同时采集血液和尿液。

在上述的猪血液作为生物样品预警克伦特罗残留的方法中，所述的步骤一为在给生 猪喂盐酸克伦特罗距停药时间为0d、0.25d、1d、1.25d、2d、4d、8d、13d、19d时分 别同时采集血液和尿液。

在上述的猪血液作为生物样品预警克伦特罗残留的方法中，所述的步骤二具体为准 确吸取一定量生猪的尿液和血液于离心管中，加入15mL的乙酸乙酯，再加入10.0％无 水碳酸钠溶液，涡旋混合1min后以4500～5500r/min的速度离心2min，吸取上层有机 溶剂于离心管中，再加入10mL的乙酸乙酯在旋涡混合器上混合1min，离心后吸取有机 溶剂并合并提取液。