[发明专利]一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及恶性疟原虫HRPII蛋白优势抗原表位串联表达的方法、恶性 疟原虫HRPII蛋白优势抗原表位单克隆抗体的制备及用酶联免疫吸附实验检 测恶性疟原虫的方法的一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法， 属生物工程技术制造领域。

背景技术

目前，由于受各种因素的影响，迄今为止，确实有效的疟疾疫苗还未投 入实际使用，因此实现疟疾的快速诊断及早期治疗显得尤为重要。传统的厚 薄血膜涂片镜检方法虽然特异，但费时费力，并且需要技术熟练的操作员， 因此该方法不适合疟疾的快速诊断。血块黄层定量法敏感性大大优于厚薄血 膜涂片镜检法，但其所使用的耗才价格昂贵，不适合临床大规模推广。近年 来，随着分子生物学及生物化学技术的迅速发展，出现了酶学法、荧光定量 PCR和免疫层析法为代表的诊断技术。其中酶学法检测敏感，准确性较高， 但需要分光光度计等特殊仪器，阻碍了该方法进一步普及。荧光定量PCR根 据疟原虫的保守序列设计引物，扩增特异性片段，标记荧光。该方法极其灵 敏，并且实现疟原虫种属区别。但该方法对技术要求较高，需专业人员操作。 目前，以免疫学为基础的血清学检测，由于其操作简便，结果易于判定，已 成为疟疾诊断的主流方向。该方法主要是利用单克隆抗体检测疟原虫的特异 性抗原，目前报道的被检抗原主要是富组氨酸蛋白(HRPII)，如世界卫生组 织推荐的ParaSight-F(dipstick)诊断试剂盒。常规的HRPII单克隆抗体制 备所使用的免疫原是基因工程技术表达的HRPII完整蛋白，由于碱基密码子 的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难，表达产物以包涵体为主，这使得单 抗的制备困难重重。另外，由于抗原表位的同源性，使用HRPII完整蛋白制 备得到的单克隆抗体也可能识别其它蛋白，如类风湿因子，从而导致检测结 果假阳性。

发明内容

设计目的：避免背景技术中的不足之处，设计一种既能够特异性识别恶 性疟原虫HRPII蛋白，又不会导致检测结果失真的一种恶性疟原虫HRPII蛋 白单克隆抗体的制备方法。

设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以恶性疟原虫HRPII 蛋白为靶抗原，分析选择A、B两个特异性优势抗原表位，序列比较结果表明 A、B两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了增强A、B两个 优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，促进A、B两个抗原表位产生 相对应的单克隆抗体，故分别将A、B两个优势抗原表位序列重复后通过柔性 片段(连续四个甘氨酸)连接，形成重组蛋白C氨基酸序列。(3)采用大肠 杆菌最嗜密码子，将重组蛋白C氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利 于目的蛋白在大肠杆菌中的表达。(4)将上一步骤得到的核苷酸序列化学合 成，通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构 建重组蛋白C表达载体。(5)重组蛋白C表达载体转化大肠杆菌ER2566感受 态细胞，筛选得到重组蛋白C表达菌株。(6)重组蛋白C表达菌株大规模培 养后，超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层 析，洗脱得到纯化重组蛋白C。(7)纯化后的重组蛋白C多次免疫Balb/c小 鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选最终得到6株 杂交瘤细胞株。(8)将6株杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用辛 酸-硫酸铵法及Protein G分两步纯化单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物 酶(HRP)。(9)ELISA正交实验筛选得到2A2单抗包被与6E8-HRP配对检测恶 性疟为最佳组合。

本申请与背景技术相比，一是通过分子生物学技术，实现了恶性疟原虫 HRPII蛋白A、B优势抗原表位的重复及串联表达，增强了目的抗原表位对小 鼠免疫系统的刺激，排除了无关序列可能带来的干扰；二是作为免疫原的重 组蛋白C仅含有恶性疟原虫HRPII蛋白特有的A、B优势抗原表位，保证了最 终得到的单克隆抗体特异性高；三是采用大肠杆菌最嗜密码子优化核苷酸序 列，大大提高了重组蛋白C在大肠杆菌中的表达水平。

具体实施方式

实施例1：恶性疟原虫HRPII优势抗原表位选择。

以恶性疟原虫HRPII蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其氨 基酸序列的亲水性及抗原性，选择A、B两个优势抗原表位。序列比较结果表 明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同 源性。