[发明专利]一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：

(1)以恶性疟原虫HRPII蛋白为靶抗原，分析选择A、B两个抗原优势表位，其 氨基酸具体序列如下：

A：LeuAsnLeuAsnLysArgLeuLeuHisGluThrGlnAlaHisValAspAspAlaHisHisAlaHisH  isValAlaAspAlaHisHisAlaHis、

B：AspAlaArgHisAlaThrAspAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHis；

(2)将恶性疟原虫HRPII蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别重复后再通过连 续四个甘氨酸连接，得到重组蛋白C氨基酸序列，其具体序列如下：

LeuAsnLeuAsnLysArgLeuLeuHisGluThrGlnAlaHisValAspAspAlaHisHisAlaHisHis  ValAlaAspAlaHisHisAlaHisLeuAsnLeuAsnLysArgLeuLeuHisGluThrGlnAlaHisValA  spAspAlaHisHisAlaHisHisValAlaAspAlaHisHisAlaHisGlyGlyGlyGlyAspAlaArgHis  AlaThrAspAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHisAspAlaArgHisAlaThrA  spAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHis；

(3)采用大肠杆菌最嗜密码子，在重组蛋白C氨基酸序列不变的前提下，将重组 蛋白C氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，具体的核苷酸序列如下：

CTGAACCTGAACAAACGCCTGCTGCATGAAACCCAGGCCCATGTGGATGAT  GCCCATCATGCCCATCATGTGGCCGATGCCCATCATGCCCATCTGAACCTGA  ACAAACGCCTGCTGCATGAAACCCAGGCCCATGTGGATGATGCCCATCATG  CCCATCATGTGGCCGATGCCCATCATGCCCATGGCGGCGGCGGCGATGCCC  GCCATGCCACCGATGCCCATCATGCCGCCGATGCCCATCATGCCACCGATGC  CCATGATGCCCGCCATGCCACCGATGCCCATCATGCCGCCGATGCCCATCAT  GCCACCGATGCCCAT；

(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点 BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，具体序列分别是GGATCC和GAATTC，通 过酶切连接，将上一步合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构建重 组蛋白C表达载体；

(5)重组蛋白C表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白C 表达菌株；

(6)重组蛋白C表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过 镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白C；

(7)重组蛋白C多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合， 经过多轮筛选最终得到6株杂交瘤细胞株；

(8)纯化单抗。