[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA检测试剂盒，具体地说是一种检测猪繁殖与呼吸 综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)主要引起怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍，仔猪和育 肥猪出现呼吸道症状，是一种高度接触性传染病(Albina，1997；Christianson et al.，1992；Mengeling et al.，1998；Rossow，1998)。本病于1987年首次在美国爆 发(Keffaber K K.，1989)，短短的十几年间，迅速遍及全球各个养猪业发达的 国家和地区，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。我国于1996年首次报 道有该病的发生，并且证明是美洲型PRRSV毒株感染所致(郭宝清，1996； 杨汉春，1997)。

PRRSV属套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒成员(Cavanagh，1997； Snijder and Meulenberg，1998)，基因组为单股正链RNA，全长15kb，包括8 个开放阅读框(ORF)，其中ORF1a和ORF1b位于基因组的5端，占据整个 基因组的80％，编码RNA聚合酶和相关的蛋白酶，为非结构蛋白(NSP1， NSP2)。ORF2～4分别编码GP2、GP3、GP4三种糖基化蛋白，ORF5～7分别 编码囊膜蛋白GP5、基质蛋白M和核衣壳蛋白N(Bautista et al.，1996；Lee and Yoo，2006；Meng et al.，1994；Meulenberg et al.，1995a；Wu et al.，2005)，这些结 构蛋白的功能逐渐得到阐明。其中PRRSV N蛋白大小约15kD，约占病毒蛋 白总量的20％～40％，是病毒抗原性最强的蛋白(Loumba et al.，1996)，其诱导 产生抗体的时间早，抗体持续的时间长(Denac et al.，1997)。N蛋白相对保守， 是诊断PRRS的候选蛋白(Yang et al.，1999)。

猪繁殖与呼吸综合征是严重危害我国养猪业的主要疫病之一，2006年夏 天出现的“高致病性蓝耳病”给我国养猪业造成了史无前例的巨大打击。此 次发病和以往的经典毒株有很大的不同，不同日龄、不同品种的猪均可感染 发病，而且发病率高、病死率高，造成了大批母猪、育肥猪死亡和淘汰，严 重危害了我国养猪业的持续健康发展(杨汉春，2008)。另外，PRRSV感染可 以造成猪群的免疫抑制，造成疫苗免疫效果下降，从而导致继发感染。应用 各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要 前提(严玉霖，2008)。

目前，国内外已建立了许多PRRSV相关的诊断技术，主要分为抗体检测 和抗原检测两大类。抗体检测方法包括间接免疫荧光法、ELISA法、免疫过 氧化物酶单层细胞试验、中和试验等。目前，临床使用最普遍的是IDEXX公 司生产的间接ELISA试剂盒。该方法重复性和稳定性较好，操作简便，适合 临床大批量样本的检测。但目前所有针对抗体的检测方法都无法区分免疫猪 群和感染猪群，从而影响疫病的及时、有效防控。而抗原检测方法则结果较 直接，能明确病毒感染。针对PRRSV抗原检测的方法主要有RT-PCR法、病 毒分离、免疫组化等，各方法均存在一些不足之处。例如，病毒分离方法耗 时、费力；免疫组化方法操作繁琐，影响因素较多，并且结果判断具有一定 的主观性。RT-PCR方法对检测人员实验操作技能要求较严格，且成本较高。 目前，国内申报的有关PRRSV抗原诊断方法的专利有3项，分别是农业部兽 医诊断中心开发的PRRSV变异株RT-PCR检测试剂盒、华南农业大学建立的 PRRSV变异株实时荧光鉴别及定量测定方法以及中国农业大学建立的利用多 对引物和荧光显色剂进行PRRSV抗原检测的PCR方法。这3项技术专利均 涉及分子生物学技术，检测结果的影响因素较多，更由于其成本因素，不利 于基层的推广和使用。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的双 抗体夹心ELISA试剂盒，其操作简单，稳定性和重复性好，具有良好的可靠 性。

本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒，其包 括：

(1)包被PRRSV N蛋白单克隆抗体(捕获抗体)的酶标板；