[发明专利]一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测流感病毒的试剂盒，具体涉及一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒、专用引物和该引物所针对的靶序列。

背景技术

自2009年4月中下旬起，源自北美的甲型H1N1流感疫情开始在全球多个国家蔓延，截至北京时间六月九日十四时，世界卫生组织确认全球七十四个国家和地区共有25288例甲型H1N1流感确诊病例，其中包括死亡病例139例。至此，中国内地共报告101例甲型H1N1流感确诊病例。甲型H1N1流感已对人类健康产生严重威胁，严重危害了人们健康，并造成重大的经济损失。快速、准确地进行流感病毒的检测是防控甲型H1N1流感的关键，一方面为防治提供依据和争取时间，另外可以减轻或消除社会恐慌心理。因此快速、敏感和特意的检测试剂盒的研制具有重大应用价值和社会意义。

2000年，日本学者Notomi等发明了一种新的恒温核酸扩增方法(Notomi T.等，Nucleic Acids Res，2000，28，E63)，即环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermal amplification)，其特点是针对靶基因的多个区域设计特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件65℃下进行反应，通过引物独特的反转设计，对自身进行链置换扩增，通常60分钟内即可完成反应。不需要模板的热变性、退火、长时间温度循环等过程。其扩增效率较高，可在60分钟内将靶序列扩增10⁹～10¹⁰倍，一般能检测到10拷贝以下的样品。由于其引物分别针对多个不同的区域，任何一个不匹配反应就无法进行，因此出现非特异性扩增的情况极少。相关方法已用于早期SARA疾病的诊断和肺炎结核杆菌等检测(PoonL.L.等，Clin Chem，2004，50(6)：1050-1052；Boehme，C.C.等，Clin.Microbiol.，2007，45，1936-1940)。通过逆转录酶环介导等温扩增法(reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification)已运用于HIV-1病毒(Kelly A.等，Journalof Virological Methods，2008，151，264-270)，禽流感病毒H5、H5N 1和H9等的快速诊断(Imai M.等，Vaccine，2006，24(44-46)：6679-6682；Imai M.等，J VirolMethods，2007，141(2)：173-80；Chen HT等，J Virol Methods，2008，151(2)：200-3)。该方法对于低浓度的病毒数量或无症状的病毒携带者的检测比RT-PCR好，目前尚未见到利用反转录和等温扩增一体化检测甲型H1N1流感病毒核酸试剂盒的报道。

目前，检测甲型H1N1流感病毒使用的试剂盒主要利用PCR方法和实时定量RT-PCR方法。PCR方法灵敏度和特异性均要低于环介导等温扩增法，且操作步骤繁琐，反应时间长；而实时定量RT-PCR方法检测需要昂贵的实时定量PCR仪，且结果需要计算机分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测甲型H1N1流感病毒的专用引物。

本发明的目的也在于提供一种含有上述专用引物的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒。

本发明的目的还在于提供上述专用引物的靶序列。

一种检测甲型H1N1流感病毒的专用引物，由4条特异性引物组成，所述4条特异性引物的序列分别为：引物F1具有序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ IDNo.4的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No.5的核苷酸序列。

一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，包括含有上述专用引物的反应预混液。

所述反应预混液为下述成分的混合液且各成分的终浓度分别为：引物F11.76μM；引物B1 1.76μM；引物F2 0.29μM；引物B2 0.29μM；dNTP 2.05mM；1.47×Bst DNA聚合酶缓冲液；MgSO₄ 11.76mM；甜菜碱1.47M。

所述试剂盒还包括Bacillus stearothermophilus(Bst)DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、AMV反转录酶和无RNA酶的ddH₂O。

所述试剂盒还包括SYBR Green I。

所述试剂盒还包括阳性模板和阴性模板。