[发明专利]一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途，属于色谱固定相制备领域。

背景技术

用固定化酶作为液相色谱固定相拆分对映体早有文献报道。1988年，Wainer等人提出了用固定化糜蛋白酶作为液相色谱的固定相来拆分手性物质。拆分了很多氨基酸、氨基酸的衍生物及二肽。1989年，他们用同样的方法合成了固定化胰蛋白酶拆分了大量O-衍生化的外消旋氨基酸。1989年，Kalbe等人固定化了糜蛋白酶和胰蛋白酶，拆分了大量芳香族和脂肪族的氨基酸酯。1992年，Marl等人合成了4种固定化糜蛋白酶，拆分了大量的对映体。2001年G.Fe′lix等人固定化了青霉素酶，他们在制得的固定相分离了大量的手性羧酸，并且该固定相作为在线反应器对某些酯也具有不对称水解效果。到目前为止，还未有人报道将固定化脂肪酶作为液相色谱固定相用于拆分对映体。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途，以提高酶在载体表面的键合量，保留酶的活性，提高柱效。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种脂肪酶键合固定相，其特征在于，该固定相由表面带有醛基的球形硅胶填料与脂肪酶的氨基以亚胺键直接键合，而后把亚胺还原为氨基制得。

所述固定相制备方法的具体步骤为：

1)环氧基硅胶的制备：在100mL三口瓶中加入3.0g球形硅胶和50mL 10％的盐酸溶液，加热回流12～14h后，停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，60℃真空干燥12h，将干燥好的硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入5～8mL 3-缩水甘油丙氧基三甲氧基硅烷和50mL无水甲苯，氮气保护下于110℃回流搅拌反应12～14h，然后停止加热，抽滤，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己烷洗净，60℃真空干燥12h；

2)二醇基硅胶的制备：将上述步骤1)中制备的环氧基硅胶置于500mL三口瓶中，然后加入300mL、pH＝3～4的硫酸溶液回流搅拌反应1.5h，然后停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，室温下真空干燥12h；

3)醛基硅胶的制备：将上述步骤2)中制备的二醇基硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入60mL 90％的醋酸水溶液和2～3g高碘酸钠搅拌反应2h，抽滤，用蒸馏水洗净；

4)脂肪酶键合固定相的制备：称取南极假丝酵母脂肪酶B 150～600mg，置于250mL三口瓶中，加入100mL、pH＝5～6的0.1mol/L醋酸盐缓冲液，搅拌溶解，加入上述步骤3)中制备的醛基硅胶3g和75mg氰基硼氢化钠，于0～4℃搅拌反应3～5天，抽滤，用pH＝8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净；所得固定相在100mL pH＝8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，在2～3h内分3次共加入硼氢化钠75mg，每次25mg，以还原硅胶表面剩余的醛基，抽滤，用pH＝8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净，得到所需脂肪酶键合固定相。

所述球形硅胶的粒径为5～30微米，孔径为200～4000埃。

所述球形硅胶由日本富士公司购得；所述南极假丝酵母脂肪酶B由荷兰Chiralvision公司购得。

所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱及在线液相色谱反应器填料。

所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱填料，分离手性化合物。

所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱填料，分离1-萘乙醇、2-萘乙醇、1-萘丙醇、2-萘丙醇或烯唑醇。

所述脂肪酶键合固定相用作在线液相色谱反应器填料，催化手性仲醇酯和3-氯-1-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不对称水解。

本发明的优点：

1)该脂肪酶键合固定相具有很高的手性识别能力，装填有这种固定相的色谱柱，既可以用做手性色谱柱，又可以用做在线液相色谱反应器；

2)该脂肪酶键合固定相的化学性质相当稳定，三个月之内都可以保持相当高的活性；

3)该脂肪酶键合固定相的制备成本相对较低，不论是装填分析柱还是制备柱都有很好的应用前景。

附图说明

图1为1-萘乙醇的拆分谱图；

图2为2-萘乙醇的拆分谱图；

图3为1-萘丙醇的拆分谱图；

图4为2-萘丙醇的拆分谱图；

图5为烯唑醇的拆分谱图；

图6为2-萘乙醇乙酯的不对称水解谱图；

图7为2-萘乙醇丙酯的不对称水解谱图；

图8为4-甲氧基苯乙醇丙酯的不对称水解谱图；

图9为4-甲基苯乙醇丙酯的不对称水解谱图；