[发明专利]固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法

说明书

技术领域

本发明为固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法，属于生物分析领域。 

背景技术

微生物具有表面电荷和两性特性，具有等电点(pI)。微生物表面电荷和等电点特性是由微生物细胞膜或细胞壁表面的氨基酸残基、糖蛋白和脂类等分子的总体带电性质所决定。因此，不同微生物以及不同生长代谢状态时的微生物均可用其表面电荷特性以及等电点特性进行表征。研究微生物表面电荷的带电特征，可表征微生物自身的生理生化特性，并对研究其生长代谢状态、检测和表征微生物表面的生化反应等具有重要的理论和应用价值。目前生物学研究上尚没有确定微生物等电点的测定方法报道。 

毛细管等电聚焦可基于蛋白质等目标分子等电点的差异进行蛋白质的分离和鉴定。近年来有报道将毛细管等电聚焦电泳应用于微生物相关研究。已报道方法是将微生物样品与等电点标记物共同进行等点聚焦，以初步分离等电点不同的微生物，并根据微生物样品和等电点标记物的相对迁移时间估算其等电点范围。因所用两性电解质具有很强的紫外背景吸收，且两性电解质在毛细管内分布不均，若使用电渗流驱动微生物在管内迁移等将导致微生物的紫外检测信号不稳定和高背景噪音信号，因此大大降低微生物检测的稳定性和灵敏度。目前生物学上尚没有通用的确定微生物等电点的测定方法和报道。 

发明内容

本发明的目的是为了解决微生物问题，而提供一种固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

本发明的一种固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法，具体测量步骤为： 

1)首先对毛细管进行预处理，依次用0.1M HCl冲洗10min以上、水冲洗5min以上、1M NaOH冲洗20min以上、0.1M NaOH冲洗20min以上、水冲洗20min以上及甲醇冲洗20min以上，氮气吹干后备用；将异氰酸酯加入无水吡啶溶液后注入毛细管中，在65～75℃反应12小时以上，使异氰酸酯键合于毛细管内壁；再依次用甲苯，甲醇，三蒸水，20mM pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗毛细管内壁，各冲洗10min以上： 

其中毛细管为石英熔融毛细管，内径50～200μm，长度20～100cm，其一端烧制检测窗口，通过紫外检测器检测样品，异氰酸酯与无水吡啶溶液比例范围为0.3∶5～10。 

2)将载体两性电解质溶液Ampholine以1％～5％体积比溶于20mM磷酸盐缓冲液中，将混合溶液注入毛细管；将靠近检测窗口的一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液，然后加10～25KV的恒定电压进行等电聚焦，待电流稳定后聚焦完成，将毛细管两端插入去离子水中，静置反应12小时以上，使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质： 

其中阴极缓冲液15～20mM的NaOH溶液，阳极缓冲液为15～20mM的H₃PO₄溶液。 

3)将上步制得的毛细管用pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗1h以上；将样品微生物加入pH7.0的磷酸盐缓冲液中制备成浓度为104～105cfu/ml样品溶液，将样品溶液注入毛细管中，采用10～25KV的恒定电压等电聚焦；待电流平稳后，聚焦完成，停止加电压；用固定气压，将毛细管内样品从聚焦段匀速推动经过检查窗口，记录对样品开始加压到经过检测窗口的时间。 

4)再次注入样品，求出采用步骤3)中的固定气压使样品从毛细管注入端流经检测窗口的时间，由于毛细管长度已知，从而得到该固定气压下样品溶液在毛细管内的匀速迁移速度，再很据步骤3)得 到的样品开始加压到经过检测窗口的时间，求出该固定气压下样品从聚焦点到经过检测窗口的距离，即可求得聚焦点到进口端的距离L差； 

5)根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值的表示公式： 

pH求＝pH始+pH差(L差/L总) 

其中“pH始”表示选用载体两性电解质溶液的pH最小值，“pH差”表示选用载体两性电解质溶液的pH范围差；“L差”表示聚焦点到进口端的距离；“L总”表示毛细管的总长度； 

6)将步骤4)求得的“L差”代入线性方程即可求出样品在聚焦点出的pH值。 

本发明的有益效果是 

1)采用固定化pH梯度，可以在毛细管内壁形成稳定连续的pH梯度，避免在溶液中使用两性电解质形成动态pH梯度，避免使用pI标记物进行管内等电点标定。压力驱动样品迁移，避免了两性电解质共同迁移对微生物检测的干扰。