[发明专利]固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法

权利要求书

1.固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法，其特 征在于具体测量步骤如下：

1)首先对毛细管进行预处理，依次用0.1M HCl冲洗10min以上、水 冲洗5min以上、1M NaOH冲洗20min以上、0.1M NaOH冲洗20min以 上、水冲洗20min以上及甲醇冲洗20min以上，氮气吹干后备用；将异氰 酸酯加入无水吡啶溶液后注入毛细管中，在65～75℃反应12小时以上，使 异氰酸酯键合于毛细管内壁；再依次用甲苯，甲醇，三蒸水，20mM pH7.0 的磷酸盐缓冲液冲洗毛细管内壁，各冲洗10min以上；

2)将载体两性电解质溶液Ampholine以1％～5％体积比溶于20mM磷 酸盐缓冲液中，将混合溶液注入毛细管；将靠近检测窗口的一端插入阴极 缓冲液，另一端插入阳极缓冲液，然后加10～25KV的恒定电压进行等电聚 焦，待电流稳定后聚焦完成，将毛细管两端插入去离子水中，静置反应12 小时以上，使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质；

其中阴极缓冲液15～20mM的NaOH溶液，阳极缓冲液为15～20mM的 H₃PO₄溶液；

3)将上步制得的毛细管用pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗1h以上；将样 品微生物加入pH7.0的磷酸盐缓冲液中制备成浓度为10⁴～10⁵cfu/ml样品溶 液，将样品溶液注入毛细管中，采用10～25KV的恒定电压等电聚焦；待电 流平稳后，聚焦完成，停止加电压；用固定气压，将毛细管内样品从聚焦 段匀速推动经过检查窗口，记录对样品开始加压到经过检测窗口的时间；

4)再次注入样品，求出采用步骤3)中的固定气压使样品从毛细管注 入端流经检测窗口的时间，由于毛细管长度已知，从而得到该固定气压下 样品溶液在毛细管内的匀速迁移速度，再很据步骤3)得到的样品开始加压 到经过检测窗口的时间，求出该固定气压下样品从聚焦点到经过检测窗口 的距离，即可求得聚焦点到进口端的距离L差；

5)根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值的表示 公式：

pH求＝pH始+pH差(L差/L总)

其中“pH始”表示选用载体两性电解质溶液的pH最小值，“pH差” 表示选用载体两性电解质溶液的pH范围差：“L差”表示聚焦点到进口端 的距离；“L总”表示毛细管的总长度；

6)将步骤4)求得的“L差”代入线性方程即可求出样品在聚焦点出的 pH值。

2.如权利要求1所述的固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物 等电点的方法，其特征在于：其中毛细管为石英熔融毛细管，内径 50～200μm，长度20～100cm，其一端烧制检测窗口，通过紫外检测器检测样 品；异氰酸酯与无水吡啶溶液比例范围为0.3∶5～10。