[发明专利]一种检测传染病病原体的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及检测传染病病原体的方法及试剂盒。

背景技术

在传染病流行的初期，准确、快速、便捷地对传染病的病原体进行检测， 是控制传染病流行的关键。虽然国内和国际上已经建立了传染病的监测系统， 但是现有的检测手段各有局限性。血清学检查利用相应的抗体与抗原结合检 测到病原体，此方法诊断快速，简单、易于操作，但必须制备出针对该病原 体的抗体后才能够进行检测，尤其是在还没有抗体来源的情况下不适用于传 染病的早期诊断。

病原体分离法是通过直接对病原体进行分离培养，检测鉴定病原体。此 方法灵敏度高、特异性强，但操作复杂、费时(至少要花费一周时间)，对实 验室生物安全条件要求非常高，所以很难在疫情发生现场采用，而且不是所 有的病原体都能通过病原体分离法获得。

核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量 PCR(Real time PCR)，灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在 DNA污染造成的假阳性率高的问题，而且由于其临界值不明显，因此检测结 果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求高，投入大，对操作人员要求 高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该方法对于病 原体含量极低的样本仍然无法检测。

NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA，依赖核酸序 列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术的 反应体系包括反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶和两条 特别设计的寡核苷酸引物，其上游引物3′末端与模板的3′末端互补，5’ 末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列，下游引物 3′末端序列与模板的5′末端序列一致，5’末端含有与捕获探针互补的序列。 在扩增起始阶段，上游引物与正义RNA模板结合后，在反转录酶的作用下 合成与靶标RNA互补的反义cDNA，而原来的的RNA模板则被RnaseH降 解。接着下游引物与cDNA杂交，在反转录酶的DNA聚合酶特性的作用下 合成双链cDNA，即对应靶标RNA的双链cDNA拷贝。由于双链cDNA一 端包含有T7 RNA polymerase的启动子序列，从而诱导了RNA聚合酶的活 性，合成大量的与靶标序列互补的反义RNA链。如此循环反复，RNA拷贝 数被不断放大。同时由于双链cDNA的另一末端还整合了与捕获探针互补的 序列，因此所产生的互补RNA又能特异的结合捕获探针，以用于下一步的 检测。

酶连接寡核苷酸捕获技术原理是NASBA扩增产物首先特异性地与捕获 探针一端结合，后者的另一端能固定连接在微孔板上，然后加入病原体特异 性检测探针及反应底物，检测产生的比色信号，这一检测读数与RNA的扩 增产物量成正比，以此来检测NASBA扩增产物总量，判断病毒模板的感染 情况。此方法操作简单，特异性强，适用于大量样品的快速检测。

鹦鹉热衣原体、卡氏肺囊虫、钩端螺旋体、Q热立克次体和布鲁氏杆菌 引起的传染病高热、倦怠无力、全身酸痛等症状明显，主要经直接接触或飞 沫传播，这些病原体致病性高并且难以区分，极易延误诊断和治疗的最佳时 机。目前尚未见报道同时能检测及鉴别上述五种传染病病原体的检测方法， 也没有相应的临床检测试剂盒上市。

发明内容

本发明目的是克服现有技术不能同时检测多种传染病病原体的缺陷，提 供一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，所述传染 病病原体包括鹦鹉热衣原体、卡氏肺囊虫、钩端螺旋体、Q热立克次体和布 鲁氏杆菌，包括：

(i)扩增生物样品的核酸片段，所述核酸片段为以下的一种或一种以上 的组合：

鹦鹉热衣原体内涵体膜蛋白A基因的如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；

卡氏肺囊虫的主要表面糖蛋白基因的如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；

钩端螺旋体促旋酶B亚单位基因的如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；

Q热立克次体外膜蛋白基因的如SEQ ID NO.4所示的核酸片段；

布鲁氏杆菌外膜蛋白omp2b基因的如SEQ ID NO.5所示的核酸片段；

(ii)用探针进行检测，所述探针与步骤(i)扩增产物中的一种特异性 杂交。