[发明专利]抗蚜虫基因PPA及其制备以及利用其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明属于新基因的制备，特别是指抗蚜虫基因PPA及其制备以及利用其编码的蛋白。

背景技术

虫害是造成农业减产的重要原因之一，全球每年因管理和利用化学杀虫剂防治费用高达100亿美元。即使如此，每年虫害导致损失占农作物总产量的20％-30％。与化学药剂相比，利用抗虫基因资源开展作物抗虫遗传育种是最经济有效和安全的措施，但是传统育种方法培育抗虫品种技术难度大、周期长，很难获得突破性的进展。转基因抗虫植物的出现为防治植物病虫害开拓了新的思路，利用Bt抗虫转基因的植物取得了显著的成果，但是使用Bt基因抗源单一，且这类基因不能有效防治某些刺吸式害虫如蚜虫等害虫，尤其是这些重要的农业昆虫还是植物病毒的传播介体，因此筛选新的抗虫基因尤其是抗蚜虫的基因具有重要的意义。

目前已开发的众多抗虫基因资源中，唯有植物凝集素能有效控制蚜虫。植物凝集素是一类能可逆和糖结合的蛋白质，可凝集人和动物的红细胞，具有多种活性功能，如抗虫、抗病毒、抗真菌等，但其最重要的功能还是体现为对蚜虫的抗性。植物凝集素是目前所知的唯一可以识别并结合昆虫肠胃及真菌、细菌等微生物表面的糖缀合物的植物蛋白，在植物中广泛存在，按氨基酸序列同源性和进化相关性分类为7个不同的植物凝集素家族，主要有豆科凝集素、单子叶甘露糖结合凝集素、几丁质结合凝集素、2型核糖体失活蛋白、木菠萝(jacalin)家族、葫芦科韧皮部凝集素、苋科凝集素等。人工饲喂试验及转凝集素基因植株的抗虫分析均表明，植物凝集素能显著抑制多种同翅目害虫(如蚜虫、褐飞虱等)的生存和繁殖。研究表明植物凝集素的抗虫活性与其特异性结合糖类的能力有关，能与同翅目昆虫消化道上皮细胞的糖蛋白结合，降低了昆虫消化道膜的通透性，影响营养物质的正常吸收。此外，凝集素还能在昆虫消化道内诱发病灶，促使消化道内细菌繁殖，使昆虫感病、拒食，生长发育受抑制，甚至死亡。1998年Keyan Zhu-Salzman使用定点突变技术，使豆科凝集素GSII丧失了糖结合能力，发现该凝集素同时也丧失了抗虫活性。由此可见，凝集素的抗虫活性与其能与糖类可逆性结合的能力密切相关。大多数凝集素的特异结合活性通常不是针对植物细胞内的糖分子，而常常是微生物或害虫的内表面的寡糖，在结合糖的过程中，植物凝集素表面局部结构的构象会有所变化，这种变化有利于识别不同的糖而结合不同的外来糖缀合物，发挥其防御功能。目前成功用于植物抗病虫基因工程的植物凝集素主要有菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin，PHA)、豌豆外源凝集素(Pea lectin，P-lec)、雪花莲凝集素基因(Galanthus nivslisagglutinin，GNA)、麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA)等。研究最多、应用最广、抗虫活性较好的为石蒜科植物凝集素GNA，是由4个单体非共价结合形成的同源四聚体，每个单体含有3个相同的甘露糖结合位点(QNDY)，属于单子叶植物甘露糖结合凝集素。

单子叶植物甘露糖结合凝集素蛋白通常有2～4个11～14KD相同亚基组成二聚体或四聚体，每个亚基包含有3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点。在石蒜科、百合科、凤梨科、天南星科、兰科、葱属等植物中广泛存在。植物中几乎不含有甘露糖，但是甘露糖却是病毒、细菌和真菌表面以及低等动物胃肠上皮细胞的糖缀合物的非常普遍的成分，甘露糖结合凝集素在植物抵抗病原微生物和食植无脊椎动物中起着重要作用。研究表明GNA对褐飞虱、蚜虫等同翅目害虫具有较强的抗性。在人工饲料中加入0.1％(w/v)的GNA蛋白，用于饲喂褐飞虱，连续饲喂五天后，90％的虫体死亡，表明GNA对褐飞虱有很强的抗性。转GNA基因植株对桃蚜、水稻褐飞虱、棉蚜、麦长管蚜等害虫表现明显的抗性。

到目前为止，虽然已发现了众多有抗虫活性的凝集素基因，然而对蚜虫等同翅目昆虫的抗性仍不尽如人意。尽管凝集素对蚜虫等同翅目害虫有抑制作用，但是现有的凝集素只能在一定程度上抑制害虫的发育，并不能完全抑制其发育和繁殖，害虫在转凝集素的植株上仍能以较低速度进行繁殖，因此，如何进一步提高凝集素的抗虫活性成为摆在人们面前的严峻事实。要解决这一问题，一方面有必要深入研究凝集素的作用机制，从而制订相应策略提高抗虫效果；另一方面应着手新的抗虫基因的发掘，为获得高抗甚至具有致死效应的凝集素基因用于抗虫基因工程研究中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗蚜虫基因PPA。

本发明的第二个目的在于提供一种抗蚜虫基因PPA的制备。