[发明专利]一种用于血友病B基因治疗的腺病毒载体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种腺病毒载体，尤其是一种可以环化后整合入宿主基因组的用于治疗血友病B的腺病毒载体及其用途。

背景技术

血友病B是X性染色体连锁的遗传性出血性疾病，其病因为凝血因子IX(FIX)基因缺陷所致，主要临床表现为反复的自发性软组织及大关节出血，反复的关节出血可导致退行性血友病关节病，严重的可以致畸致残，血友病B患者出血的严重程度与循环中FIX的水平相关。目前预防性因子替代疗法已经大大降低了出血发生的频率以及血友病性关节疾病的发生，并提高了血友病患者的生存期和生活质量，但是患者仍存在致命性出血和慢性关节损伤的风险。此外纯化FIX价格昂贵，在发展中国家绝大多数患者不可能实施终生的预防性治疗。尽管重组FIX因子可以使患者免于输注血浆浓缩FIX导致的传染性疾病，但大多数发展中国家的患者仍使用血浆来源的FIX，仍然有感染传染性疾病的风险。

然而血友病B本身的特点为基因治疗提供了非常有利的条件：①其临床表现完全是因单一特异的基因产物FIX缺乏造成的，FIX以微量在血浆中循环；②FIX基因编码序列相对较短(约1.5kb)，这使其容易包装并易于载体转染到靶细胞；③FIX半衰期相对较长(大约20小时)；④功能性的FIX表达不需要特定的组织器官；⑤最重要的是，血浆FIX水平不需要严格的调控，其血浆水平的轻度升高(生理水平的5％)即可显著改善患者的出血症状。所以，基因治疗作为血友病B的治疗手段前景十分看好。目前血友病B的基因治疗主要使用病毒或非病毒载体把hFIX(human FIX)基因转染到靶细胞。病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒。腺病毒载体是在基因治疗、基因免疫等方面应用开发得较早的一种基因载体，在美国近三分之一的基因治疗临床试验中采用腺病毒载体。腺病毒载体的容量大，安全性高，在体外稳定，易于制备与纯化，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细胞并以较高水平表达外源基因。腺病毒载体的不足之处在不能整合到宿主染色体上，所以不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予载体制剂治疗，但这样又能刺激免疫反应，使反复治疗的效果会逐渐降低。腺相关病毒为基础构建基因转移载体的优点是安全稳定，感染宿主细胞广泛并能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减少了插入突变的可能性，但是它难以大量生产，复制需要辅助病毒，并且包装外源基因的能力有限，小于5kb，因此腺相关病毒的利用受到一定限制。逆转录病毒载体能使外源基因完全整合到宿主细胞染色体上，但也有明显的不足，主要表现在以下几个方面：1)不能感染非分裂的细胞；2)可能产生具有复制能力的病毒；3)由于是随机整合，可能会引起“插入诱变”，诱导肿瘤的发生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对单纯腺病毒的短效性，逆转录病毒的不安全性，腺相关病毒的包装复杂性，提供一种定点整合入宿主基因组的安全的用于血友病B基因治疗的腺病毒载体及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于血友病B基因治疗的腺病毒载体，该载体能同时表达hFIX与红色荧光蛋白；在hFIX与红色荧光蛋白串联基因表达框两侧各有一个方向相同的Cre整合酶作用位点loxp位点，在表达框内部有位点特异性整合酶PhiC31的作用位点attB。

在其中一个Loxp位点与目的基因启动子之间存在一个attB位点，使其能在Phic31整合酶存在的情况被整合到宿主基因组中。

所述目的基因表达框5’端的loxp与attB相邻，形成loxpattb片段。

能表达红色荧光蛋白，能作为腺病毒包装时的示踪蛋白，并且与传统绿色荧光蛋白的腺病毒载体相区分，当两种腺病毒共同作用与宿主细胞能进行区分与示踪。

能表达人凝血因子FIX。

所述的腺病毒载体或其体外包装的腺病毒颗粒在治疗血友病B药物中的应用。

本发明的有益效果：得到由红色荧光蛋白标记的DNA可以环化的重组腺病毒载体，并为该载体进一步经由attb序列整合入宿主基因组中发挥持久治疗血友病B打下基础。

附图说明

图1载体A中的loxp序列。

图2载体C经BamHI和BstXI双酶切鉴定(1：DL2000Marker；2：载体C BamHI+BstXI)。

图3载体E中loxpattb片段测序图。

图4载体Bgl II和SacI凝胶电泳分析(1：DL2000marker；2载体B BglII+BamHI)。