[发明专利]一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于过敏原检测技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测过敏原的技术， 特别是食品中过敏原榛果成分的方法。

背景技术

食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反应。 近二十年来，食物过敏逐渐被重视，已被认为是严重的公共卫生问题，而且WHO预测食物 过敏可能成为今后最常见的流行病之一。根据美国FDA资料统计，在美国，2％的成年人和 5％的婴幼儿患有食物过敏症，每年大约30000人需要临床紧急治疗，150人死于食物引起的 过敏反应。在所有过敏反应中，花生和树坚果过敏占10-47％。

FDA于2005年10月5日发布《食品过敏原标识和消费者保护法案-2004》(FALCPA)， 规定主要食物过敏原包括树坚果等八种食物的成分。日本标签标注也要求将树坚果列为推荐 标注成分。据国外有关学者应用ELISA方法结合PCR-ELISA法对商品进行调查，在41种 市售商品中就有27种含有过敏原榛果成分而未在标签中标识。

目前国内外对过敏原榛果成分的检测研究主要集中在ELISA、PCR-ELISA、PCR、荧 光PCR及生物传感器检测等方面。目前对于过敏原的检测方法FDA和AOAC共同研究推荐 使用的试剂盒有三种，均为ELISA方法。但如果产品中蛋白质遭到破坏，ELISA方法就检测 不到。而DNA比蛋白质稳定，PCR方法较ELISA方法更为准确，并且避免了对大量抗体的 需求，欧盟、日本和AOAC都建议使用PCR方法进行确证，但没有明确特异性的引物序列。 本研究针对榛果成分rCor a 1.0401DNA序列设计引物及TaqMan探针，建立了运用荧光PCR 技术检测食品中过敏原榛果成分的方法。

发明内容

针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了运用荧光PCR技术检测食品中 过敏原榛果成分的方法，具体的讲就是，外切酶探针荧光PCR技术(Taqman探针法)检测 食品中过敏原榛果成分的方法。

其技术内容包括：使用该方法所使用的引物、探针及构建的报告质粒。其中引物、探针 的全部序列如下：

引物：

所用引物序列一：CCCCGCTGTTTGTGATAT

所用引物序列二：ATGATAATAAGCGATACTGTGAT

探针：

所用探针序列：TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT

以及由上述序列衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义 互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。还包括与之配套的荧光PCR反应条件。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物、探针，将探针法探针序列三用FAM荧光基团标记，用 于外切酶探针荧光PCR技术检测；

(2)以探针法引物序列一和探针法引物序列二作为引物，以食品中过敏原榛果成分的相 关基因DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；

(3)扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过 配套软件进行分析可以观察到对食品中过敏原榛果成分进行特异性扩增产生的特定波长的 FAM荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原榛果成分；如没有观察到任何一种荧光 信号则证明待测样品中不存在食品中过敏原榛果成分。

本研究所建立的荧光PCR方法，与花生、麦粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等没有 交叉反应，具有很好的特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。

本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下：

荧光PCR扩增程序如下

(1)50℃ 2分钟

(2)95℃ 10分钟

(3)95℃ 15秒

(4)60℃ 1分钟

(5)回到第3步，重复45次

扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过配套 软件进行分析可以观察到对食品中过敏原榛果成分进行特异性扩增产生的特定波长的FAM 荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原榛果成分；如没有观察到任何一种荧光信号 则证明待测样品中不存在食品中过敏原榛果成分。