[发明专利]门多萨假单胞菌NK-01用于生产褐藻寡糖的用途和方法

说明书

技术领域

本发明涉及门多萨假单胞菌用于生产多糖类生物降解高分子，特别是利用门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01CCTCC M 208005(简称门多萨假单胞菌NK-01)生产褐藻寡糖的用途和方法。

背景技术

褐藻寡糖是褐藻多糖的寡聚物，是聚合度小于20的褐藻多糖。褐藻多糖是由海藻和细菌合成的一种多糖，在海藻中褐藻多糖主要起骨架作用，而在细菌中的褐藻多糖是细胞壁的一种成分，阻止抗生素进入细胞内，有的细菌则将合成的褐藻多糖分泌到细胞外。海藻酸钠或褐藻酸钠是由褐藻多糖链上糖醛酸的羧基氢被钠取代的产物，它们又名藻酸盐。

来自海藻的褐藻多糖是由β-D甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通过β-(1→4)/α-(1→4)键连接而成的无支化线性多糖。其中β-D甘露糖醛酸中的C5被差向异构化即是α-L-古洛糖醛酸。褐藻多糖中有三种类型的链段(Block structure)，其一是完全由β-D甘露糖醛酸按照β-(1→4)键结合的M-M型；其二是完全由α-L-古洛糖醛酸按α-(1→4)键结合的G-G型；其三是由β-D甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸混合交替结合的M-G型。来自细菌的褐藻多糖和来自海藻的褐藻多糖具有相同的基本结构，差别仅在于细菌褐藻多糖中C₂和/或C₃羟基常常不同程度地被乙酰化，乙酰化程度因菌株及生长条件的不同而有明显的不同。而褐藻寡糖和褐藻多糖的区别在于，褐藻寡糖是聚合度小于20的褐藻多糖。

褐藻寡糖产物有诸多用途。例如，有报道称，饲料中添加少量褐藻寡糖，能改变动物消化道微生物菌相，提高动物日增重，提高饲料吸收利用率，降低消化道和畜产品中大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌数。另有报道，褐藻寡糖还具有促进植物生长作用。据报道寡糖能够诱导植物抗病性，提高植物抗逆能力及调节植物生长从而对改进作物的品质，在增加作物的产量方面具有重要意义。因此，褐藻寡糖可以广泛应用于食品、制药、化工等多个领域，具有广阔的开发前景。

化学合成法主要缺点是需要多重基团保护和去保护步骤，产量低，大量合成复杂的化合物不能通过常规的化学法得到，因而没有实际的工业价值。用酶法制备褐藻寡糖，多是先分离纯化得到褐藻寡糖裂解酶后再制备褐藻寡糖系列产物，但酶的分离纯化比较繁琐，且在这一过程中酶也容易失活，酶法合成的价格也比较昂贵。本发明用微生物合成褐藻寡糖属液体发酵，工艺简单，发酵周期短，适合大规模工业化生产。

本发明用于生产褐藻寡糖的门多萨假单胞菌NK-01，自天津市西青区付村的大田土壤中分离得到，已于2008年1月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国湖北武汉武昌珞珈山，武汉大学内)，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M 208005。

该菌具有利用碳水化合物产酸的特性，可在Luria-Bertani(LB)(成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L氯化钠)培养基上生长，呈浅黄色，圆形菌落，边缘整齐，生长快。其16S rRNA基因的核苷酸序列长度为1454bp，在GenBank中的登录号为DQ641475。使用BLAST对NK-01菌株的16S rRNA基因和GenBank中已登录的细菌的16S rRNA基因做同源性比较，结果显示这个核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的多种细菌具有很高的同源性，且与已经报道的Pseudomonas mendocina ymp ctg68菌株的16S rRNA序列相似性最高。从GenBank里得到与门多萨假单胞菌NK-01菌株的16S rRNA基因序列相近的序列，利用DNA star软件与NK-01菌株的16S rRNA基因序列作比较后，建立了门多萨假单胞菌NK-01基于16S rRNA基因的系统进化树。

发明内容

本发明的目的是提供门多萨假单胞菌NK-01用于生产褐藻寡糖的用途以及提供利用上述门多萨假单胞菌NK-01低成本生产褐藻寡糖的方法。

为实现这一目的，本发明采用以下技术方案：利用门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)NK-01 CCTCC M 208005生产褐藻寡糖的方法，包括以下几个步骤：首先将该菌在含有5ml LB培养基的L管中进行活化培养，然后将活化的菌种接种到发酵培养基上培养，发酵结束以后离心除去菌体，上清液用3倍体积的无水乙醇沉淀，去上清后沉淀用水溶解，然后用定性滤纸过滤，之后滤液进行冷冻干燥，得产物褐藻寡糖。