[发明专利]氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及一种氨基功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球的制备方法。

背景技术

生物分子的标记和检测一直是生物分析领域的重要内容。目前对蛋白质研究使用最普遍的荧光探针是有机荧光染料，有机荧光染料虽然在生物偶联方面已经有了深厚的研究基础，但由于其激发光谱窄、发射光谱宽、容易出现光漂白，同时由于不同染料的荧光需要不同的激发光源，很难实现多指标同时检测，这些缺陷在一定程度上限制了它们的广泛应用；而半导体量子点(QDs)则具有颜色随着尺寸可调，单一光源能激发多种颜色量子点，发射光谱具有狭窄的半峰宽和对称的结构等优点。以量子点为基础的荧光技术具有无损检测、操作简单、结果直观、测量快速、灵敏度高以及费用低等优点，自1998年Science杂志首次报道量子点用于生物医学分析以来，半导体量子点作为一种新型荧光探针，目前已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。

近些年来，随着人们在科研和生物医学诊断上要求的不断提高，荧光编码微球已经成为一个主要研究的主题。荧光编码微球是一种载有两种或两种以上的荧光物质的新型功能化微球，它能够从单个样品中进行不同生物分子的平行检测，能从复杂目标中取得相关信息，如从多个蛋白或者多个基因中识别靶向目标。荧光微球由于在单个微球中包埋了多种颜色的荧光物质，可以对不同的荧光微球进行光学编码。同时，微球大的比表面积可以更多的捕获分子，为生物分析提供了一个高灵敏的平台。其在许多领域具有广泛的应用前景，如免疫分析，基因、蛋白的标识与检测以及细胞分类与成像。

就荧光编码微球的制备方法而言，目前文献报道的主要可以分为三类，一是通过溶胀的方法，将量子点包到微球内；Nie等最先使用溶胀聚苯乙烯微球的方法制备了量子点荧光编码微球(M.Han，X.Gao，J.Z.Su，S.Nie，Nat Biotechnol.2001(19)：63)，溶胀法是最简单的方法，但是使用这种方法的聚苯乙烯微球表面会表现出很强的表面纹理，这种纹理很容易阻挡微球内部量子点对光的吸收和荧光发射，另外使用这种方法制备的荧光编码微球，其内部的量子点主要吸附在聚苯乙烯微球的内壁上很容易渗漏出来。二是通过层层自组装的方法使量子点吸附在微球外部。苏等人通过层层自组装的方法，利用静电引力使带负电荷的不同颜色的量子点吸附在聚苯乙烯微球的表面制备了荧光编码微球(Q.Ma，X.Wang，Y.Li，Y.Shi，X.Su，Talanta 2007 (72)：1446)，这种方法的缺点是中间的聚电解质层会减弱量子点的荧光强度；并且用这种方法制备的荧光编码微球通常体积比较大，在细胞分析中受到很大局限性；三是在水/油相中利用正硅酸酯水解包覆荧光物质形成核壳结构，主要方法为反相微乳液法。反相微乳液法操作简单、直接，通过此法制备的二氧化硅微球尺寸可控、表面光滑，并且很容易与其他功能基团相连，并具有很好的生物适应性。王等人利用反相微乳法将两种有机染料同时包埋在二氧化硅微球内制备了荧光编码微球(L.Wang，C.Yang，W.Tan，Nanoletters 2005(5)：37)，但此方法使用的是有机荧光染料作为荧光材料，由于有机染料具有狭窄的激发带，不对称的荧光发射峰以及光褪色等缺点，这限制了它作为荧光探针的使用。反相微乳液法对于量子点的包覆，目前只限于单色荧光量子点，因为两种量子点直接混合易发生能量转移，产生荧光猝灭，故尚未有利用此方法制备荧光编码微球的报道。本发明正是克服这个技术难关，利用反相微乳法成功地制备了稳定性高、荧光强度大的磁性荧光编码微球。

磁性微球的研究始于70年代，自80年代以来，这一领域的研究日渐活跃，各国竞相在这一很有经济效益的领域展开角逐。磁性微球的制备国外有不少报道，国内开展这方面的工作则是近些年的事，1993年孙宗华课题组制备出大粒径苯乙烯磁性微球，1995年张津辉利用Co60.Y-射线辐射聚合制备了不同功能团的磁性微球。其中比较成熟已经商品化的是Dynal公司的产品，但由于其操作极为繁琐，需要专门设备和技术，因此Dynal公司的产品价格昂贵，并且在国内无代理商。近几年来随着对磁性微球研究的深入，磁性微球的许多应用已经或者正在被开发出来，磁性微球的应用领域从原来的分离、诊断、靶向载药外延到荧光免疫分析、免疫电化学发光、基因测序等领域，特别是伦敦儿童医院、挪威工科大学和美国喷气研究所利用纳米级磁性微球成功地进行了人体骨髓液瘤细胞的分离来治疗患者，该工作的成功无疑增强了人们的信心，加速了该领域的研究进展。