[发明专利]检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，确切地说利用分子生物学检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试 剂盒，特别是鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株的检测。

背景技术

鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis，DVE)，俗称“鸭瘟”、“大头瘟”或“烂肠瘟”。是鸭、 鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。流行广泛传播迅速，发病率高和死 亡率大。

近十多年来，我国养鸭业获得迅速发展，据2002年根据联合国粮农组织(FAO)统计， 我国鸭存栏约6.61亿只，占世界总量的69.7％，可见我国是第一鸭生产大国。而且以每年10％～ 15％的速度递增，新建的大规模养殖场逐渐增多，鸭产品的年产值已经接近300亿元人民币， 而且远销欧盟、东南亚、日本、韩国等地，随着国民经济的进一步发展，鸭产品空间还会不 断扩大，所以养鸭业存在巨大的潜力。但由于各地多渠道引进种鸭或蛋，国内禽产品市场交 流频繁，集约化饲养缺乏管理经验，防疫工作措施不当，环境污染严重，导致鸭的各种疾病 不断发生，而且越来越复杂，但危害较为严重的仍为病毒性传染病，每年引起鸭死亡占到15％～ 20％，严重制约着我国养鸭业的持续稳定发展。截止目前，我国从国外引进种鸭(蛋)2000 万只，鸭瘟是每次进出境种鸭(蛋)必检的项目。

目前诊断鸭病毒性肠炎的常规检测方法有：1.临床综合诊断；2.病毒的分离和鉴定； 3.微量血清中和试验；4.琼脂糖凝胶沉淀试验(AGP)；5.酶联免疫吸附试验(ELISA)；6. 免疫荧光或免疫酶检测技术。而且一种方法难以确定诊断，最后要经过以上几种方法试验进 行综合判断。这些方法用于鸭瘟诊断耗时长，敏感性、特异性差，不利于快速、准确诊断该 病。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低、适于大规模检疫和 防疫监测的检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试剂盒。

检测鸭病毒性肠炎的PCR方法的引物：

P1(37154-37173)：5′-CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT-3′

P2(37580-37599)：5′-GAAGGCGGGTATGTAATGTACA-3′。

检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，包括以下步骤：

(1)常规方法提取待检样品基因；

(2)将引物P1、P2与PCR混合液加入PCR反应管中混合后加入待检样品DNA，加入待 检样品基因；

(3)将放入PCR反应管放入PCR检测仪中进行反应；

(4)取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳；

结果判定：有扩增产物约446bp，核苷酸序如序列表SEQ ID NO.1，为阳性；无扩增产物 约446bp为阴性；

步骤(2)所述的PCR混合物包括：PCR缓冲液、dNTP、rTaq酶；

按引物P1(10μmol/L)    1μL、引物P2(10μmol/L)    1μL、

10×PCR缓冲液(10mmol/L)5μL、dNTP(10mmol/L)       4μL、

rTaq酶(5U/μL)         0.25μL、待检病毒DNA模板   3μL、

加纯水至总体积         50μL；

本发明检测鸭病毒性肠炎的PCR的方法，阳性对照品为鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株，质量浓 度选自0.07μg/μL的10²～10⁹倍倍递增稀释液。

步骤(3)按①温度94℃、时间5min，1个循环；②温度94℃、时间30s，温度47℃、 时间30s，温度72℃、时间35s，35个循环，进行PCR反应；

检测鸭病毒性肠炎的PCR的试剂盒它包括：

溶液1：1比1比例的引物P1、P2；

溶液2：包括5∶4∶0.25比例的10×PCR缓冲液(10mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、 rTaq酶(5U/μL)；

检测鸭病毒性肠炎的PCR的试剂盒的使用方法：

(1)将所述溶液1：2μL与溶液2：9.25μL加入PCR反管内混合后，分别加入待检 样品DNA溶液、阳性对照品、阴性对照、空白对照3μL，加纯水至总体积50μL；