[发明专利]电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法。特指东亚钳蝎的电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法。

背景技术

电压门控钠通道(VGSC)在神经元以及其它可兴奋性细胞动作电位形成和传导过程中扮演着极为重要的角色。

VGSC的细微突变或异常表达会导致其相应的功能改变，甚至诱发诸如神经肌肉周期性麻痹症，心脏长QT间隔综合征(LQTs)、癫痫以及一些遗传性疾病(Aschroft，2000)。此外，VGSC还被认为参与了神经病理性痛的发生和维持。

与哺乳动物含多种钠通道基因不同，昆虫钠通道的基因相对较少，目前已被克隆和测序的昆虫para直系同源钠通道基因(para-orthologous sodium channel gene)有果蝇(Drosophila melanogaster)中的para基因、家蝇(Musca domestica)中的Vssc1基因(也称Msc基因)、烟草蚜虫(Heliothis virescens)中的hscp基因、德国小蠊Blattella germanica中的para^CSMA。

钠通道呈现出的亚型多样性，为理解钠通道在生理/病理下的功能特性及其动态平衡调控带来了复杂性。例如，目前临床上癫痫、神经病理性痛等的治疗药物通常以钠通道为靶器，但由于其选择性不高，可能产生严重的副作用。再如，昆虫钠通道是DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的主要作用靶点，但长期使用和滥用，一方面严重的污染了环境和危害公共健康；另一方面导致了昆虫抗药性的出现，其敏感性的变化是由于昆虫的para钠通道基因序列在杀虫剂和神经毒素结合位点处发生了突变。

因此，开拓对不同通道亚型具有特异选择性作用的配体/调制剂并解析新型通道亚型的基因编码特征，不仅有利于各亚型生理功能的阐明与药理价值的评估，同时也为钠通道关联的临床疾病治疗药物以及高效生物杀虫剂研制提供理论的可行性和新分子先导物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新型电压门控钠通道基因。

本发明的目的之二在于提供一种新型电压门控钠通道基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供新型电压门控钠通道基因的克隆方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种电压门控钠通道基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；

(2).与序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

一种根据上述的电压门控钠通道基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或者是将序列18-28的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列14-26的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

一种根据上述的电压门控钠通道基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.从东亚钳蝎的腹神经纤维中提取总RNA；

b.用Superscript II反转录酶和Oligo-(dT)引物合成单链cDNA；

a.借鉴昆虫Para钠通道的保守氨基酸残基设计退火引物，再采用兼并PCR以及cDNA末端的快速扩增技术，得到全长cDNA；所述的退火引物为下表：

本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，兼并PCR(Nested-PCR)以及cDNA末端的快速扩增(RACE)技术，得到了东亚钳蝎的全长cDNA。并根据序列分析结果，对rNav1.5DIV/S3-S4胞外环相应氨基酸进行点突变，运用电生理手段检验突变体对BmKI的敏感性，借此探明钠通道与特异性调制剂BmKI结合的关键性氨基酸，为蝎钠通道对自身分泌毒素-BmKI不敏感的现象提供合理的解释。证明BmNav1用于电压门控钠通道的表达及药理调制机制的研究，并为离子通道病的防治和开发通道型药物提供新型通道分子模板。

本发明的电压门控钠通道基因可以作为研究特异性相关调制剂药理效应及其功能机制的模板。另通过突变实验以及电生理记录检验了突变体对特异性钠通道调制剂BmK I的敏感性，证明该新型钠通道基因可作为膜离子通道调制剂作用机制的研究模板。

附图说明

图1为新型钠离子通道克隆实验策略。