[发明专利]一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法和用途

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及复制缺陷型腺病毒，具体涉及一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，尤其涉及一种用于肿瘤基因治疗的复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制的方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的最主要的疾病。传统的手术、化疗和放疗等方法目前仍然无法明显改善人们对这类疾病相对无奈的局面。基因治疗经过二十年的发展，作为一种新的治疗肿瘤的手段越来越受到人们的关注，截止2009年1月，全球已实施的1472项基因治疗临床试验方案中，用于肿瘤治疗的有960项，占65.2％。腺病毒(Adenovirus，Ad)是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。据报道，在已实施的基因治疗临床试验方案中，使用腺病毒作为载体的有360项，占24.5％，居首位。2004年1月及2005年10月我国SFDA在国际上率先批准了二个以腺病毒作为载体的治疗恶性肿瘤的工类新药。

腺病毒的有效性和安全性问题一直是制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈。现有技术公开了腺病毒载体用于基因治疗有许多优点：如可插入较大的外源基因片断(8.5kb)、容易制备且病毒滴度较高、宿主范围广、可介导外源基因短时高水平表达、基因转移效率不受细胞增殖状态影响、其基因组通常不会整合入宿主细胞染色体，故不易发生插入突变，较安全等。但腺病毒载体在应用特别是体内应用时仍存在一些问题：①腺病毒载体介导外源基因表达时间短。由于腺病毒载体的免疫原性较高，进入体内的病毒很快被机体清除，一般仅持续7-10天。②外源基因表达水平仍然不够理想。虽然腺病毒载体可介导外源基因短时高水平表达，但由于目前治疗基因都不够有效，并且用于基因治疗的腺病毒载体多数是复制缺陷型载体，在体内不能复制，而用药剂量过大会导致急性毒性反应，所以对于肿瘤基因治疗来讲外源基因表达水平显得仍然不够理想，而通过加大用药剂量提高外源基因表达水平的空间几乎为零。③非特异性分布及病毒泄漏导致的毒副作用。由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感染其他正常组织，体内应用时存在明显的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生毒副作用，且该问题随着腺病毒在临床实践中的应用而日见突出，因此，临床应用时大都直接或通过介入方式将腺病毒注射到肿瘤内。然而，实践表明，即使是肿瘤内给药，大量的腺病毒仍然会泄漏到循环血液中，并感染其他正常组织特别是肝细胞，其中，在使用复制型腺病毒时更为严重。以上问题已成为制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈。故，基因治疗的有效性和安全性问题一直是基因治疗研究和临床试验的一大热点和难点问题。

研究人员认为，解决上述腺病毒有效性的策略之一是采用“增殖型腺病毒系统”也称“溶瘤病毒”，但安全性会降低。由于增殖型腺病毒存在潜在的安全性问题，目前已实施的基因治疗临床试验方案中大多数使用的仍然是复制缺陷型腺病毒载体，此类病毒基因组中不含腺病毒复制必须的E1区基因，E1区是腺病毒基因组进入细胞核后立早表达的基因，对后续其他基因的表达以及病毒复制起到至关重要的作用。有研究在一些细胞系的基因组中整合了腺病毒基因组左端一段包括E1区基因的序列，构建了所谓腺病毒包装细胞系(如293、911以及PERC6等)，这些细胞系可以反式提供E1区的功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。此类腺病毒在体内不能复制，比较安全，但限于客观情况，目前基因治疗效果仍不理想。

增殖型腺病毒系统又称为肿瘤特异性增殖型腺病毒，该载体利用肿瘤与正常组织及细胞间结构或代谢途径上的差异，使病毒可以特异性地靶向肿瘤细胞内复制、增殖，大量表达目的基因并最终裂解肿瘤细胞。增殖型腺病毒与传统的复制缺陷型腺病毒载体比较有以下几个优点：①病毒的大量增殖可以直接杀死感染的肿瘤细胞，并扩散到邻近肿瘤细胞；②腺病毒溶解肿瘤细胞能释放肿瘤抗原，提呈给树突状细胞和T细胞识别，起到″瘤苗″的作用，产生抗肿瘤免疫反应；③除了自身的溶瘤能力，增殖型腺病毒载体在大量复制增殖的同时还可使所携带的外源基因大量表达，通过多种途径杀灭肿瘤，即病毒-基因疗法。如果治疗基因和增殖病毒的优势都能充分发挥的话，增殖病毒携带治疗基因的药物很可能将是临床最成功的基因治疗药物。但大量的腺病毒泄漏到循环血液中，直接感染其他正常组织以及由于免疫反应而导致急性毒性反应，这一安全性问题在使用复制型腺病毒时显得更为突出。