[发明专利]堆肥中生物酶基因多样性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因多样性的方法，尤其涉及一种堆肥微生物总DNA中基因多样性的 分析方法。

背景技术

堆肥是利用微生物对可生物降解固体废物进行分解，从而对其实现最终处理的一种系统， 因此，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。对堆肥进 行微生物群落研究的传统方法主要是微生物培养和纯种分离技术。因为环境中的绝大多数微 生物无法通过培养方法进行研究，而且堆肥中微生物种类繁多，常处于动态变化状态，培养 研究无法反映系统中微生物种群的动态变化，因此，这样的研究方法无法满足堆肥微生物学 研究的要求。

分子生态学技术正是一种能不依赖于微生物分离培养而对其进行研究的新技术。目前， 分子生态学研究已经涉及到环境科学研究的众多领域，包括在堆肥微生物分子生态学方面的 研究。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)正是其中应用最为 广泛的一项技术，其原理是：DNA进行电泳时使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶， 该凝胶能够有区别地解链PCR扩增产物。长度相同而在碱基序列上存在差异的不同DNA在 进行变性梯度凝胶电泳时，会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。DNA 双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环形，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度 将会急剧下降；以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开 的条带，这样便能将具有相同长度而序列有差异的DNA分子分离开。该技术可以分辨具有 相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及 PCR扩增DNA片段的多态性。

目前，对环境中功能基因的分离和多样性的研究还要结合构建克隆文库的方法，但是该 方法却不适合对堆肥过程中多种功能基因的分离和多样性的研究，其原因在于：构建一个克 隆文库必须一次性挑取几十甚至上百个克隆子，而堆肥又是一个不断变化的动态过程，因此， 如果要对堆肥过程中的多个功能基因进行分离以及进行后续的多样性研究就必须构建多个克 隆文库，这不仅大大增加了工作量，一定程度上还会增加实验成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高通量、低成本、简便直观 的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能(例如木质 素的降解等)的微生物种群。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方 法，包括以下步骤：首先提取堆肥中的微生物总DNA，该微生物总DNA的提取过程又包括 样品的脱腐、DNA的粗提和DNA的纯化三个步骤；然后利用PCR扩增程序对特定生物酶基 因进行扩增；再在1×TAE缓冲液中，60℃恒温、100V恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳 12～14h；最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。

上述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，具体包括以下步骤：

(1)提取堆肥中的微生物总DNA

样品的脱腐：向待提取DNA的堆肥样品中以8～15ml/g堆肥的用量加入去腐缓冲液，然后 置于60～65℃的水浴中保温3～8min，保温期间可将样品与去腐缓冲液轻轻搅匀，再以 3000～5000×g离心5～7min，去上清；重复本步骤直至离心后的上清颜色与所述去腐缓冲液的 颜色无明显差异(一般重复1～2次即可满足要求)；