[发明专利]牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗生素残留检测，具体是指牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法。

背景技术

在奶牛养殖业中β-内酰胺环类的抗生素常用于医治奶牛的乳腺炎，尤其是青霉素G由于其广谱并廉价因此被大量地使用，因此导致了牛奶中含有高浓度的残留。且青霉素类还会使一些个体产生十分剧烈的过敏反应。如果长期摄入含有该类抗生素的牛奶会使人体肠道内正常菌群受到抑制并使人产生抗药性。许多国家对牛奶中的β-内酰胺类药物尤其是青霉素G残留的管理十分严格，世界卫生组织推荐的青霉素G在牛奶中的限量由1976年的0.05μg/ml(50ppb)提高到目前的0.004μg/ml(4ppb)，美国为0.005μg/ml(5ppb)。目前按国家标准GB4789.27-2003鲜乳中抗生素残留量检测方法进行检测，检测限仅为0.04μg/ml(40ppb)，该法灵敏度低，与欧美国家检测方法差一个数量级，已不适应国际需要。

中国发明专利200410019478.5(CN 1584046A)公开“检测牛乳中抗生素残留量的微生物制剂制备方法及其应用”，该方法的检验时间长约需要5小时左右，用的菌株是嗜热乳酸链球菌，发酵温度为40～45℃。王志强等人“微生物抑制法快速检测鲜奶中多种抗生素残留”(中国食品卫生杂志，2008，20(2)：139-141)没有制成试剂盒，检测时间长达24h以上，操作步骤复杂。

上述的检测方法都是采用微生物检测法，普遍存在由于检测活菌量低(10⁵～10⁶cfu/ml)且热稳定性差，灵敏度低，检测时间长，没有制成试剂盒，使得检测操作繁琐，无法进行标准化检测。而酶联免疫检测法和放射免疫分析法(也叫Charm II)需要昂贵的检测仪器，费用高，每个样品的检测成本为100～300元，不适合乳品企业的低成本的检测需要。牛奶中抗生素残留的检测不仅仅涉及到乳品企业的经济效益，更大地涉及到人类健康的公共卫生问题，因此，为了提高牛奶的安全性，开发低成本、高通量、快速检测和灵敏度高的检测试剂盒势在必行。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种低成本、高通量、检测速度快和灵敏度高的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法。

本发明利用嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearothermophilus)对β-内酰胺类抗生素敏感的特点，检测β-内酰胺类抗生素的残留。首先将嗜热脂肪芽孢杆菌进行高密度培养，然后浓缩菌体，与培养基、指示剂和反应助剂在高温条件下灌注，制成凝固的试剂盒。被检奶样中可能存在的抗生素小分子向培养基内扩散，而样品中干扰芽孢繁殖的其它大分子被隔离在琼脂培养基的表层。当含有检出限以上浓度的β-内酰胺类抗生素时，嗜热脂肪芽孢杆菌的生长被抑制，培养基保持原有色泽(蓝色)，为阳性；当无抗生素或抗生素含量很低时，嗜热脂肪芽孢杆菌就会生长繁殖利用培养基里的营养物质产酸，使指示剂变色(黄色)，为阴性。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，包括如下步骤和工艺条件：

第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌冻干粉置于肉汤液体培养基，于45～55℃，100～150rpm下培养24～36h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基原料配方为：蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水94.4～96.1份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至45～55℃备用；

第二步以体积比为2～5∶100的比例，将母发酵剂接入生产培养基中，于50～65℃的发酵罐中进行培养，在培养过程用NaOH溶液调整pH为7.0～8.0，搅拌转速为100～150rpm，培养24h～36h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基原料配方组成为：蛋白胨1.5～3.0份，牛肉膏为2.5～3.5份，葡萄糖为1.0～2.0份，磷酸氢二钾0.010～0.030份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水91.37～93.59份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至50～65℃备用；

第三步将所述发酵菌悬液于5000～8000rpm条件下，离心20～25min，舍弃上清液，收集菌泥A；