[发明专利]一种烟草普通花叶病抗性的离体快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物对病害抗性的鉴定方法，特别涉及一种烟草普通花叶病抗性的离体快速鉴定方法。

背景技术

烟草普通花叶病(Tobacco mosaic virus，TMV)是烟草生产中危害最为严重的病害之一，其危害不仅造成烟叶产量的重大损失，而且使烟叶品质严重下降。目前对烟草普通花叶病仍然缺乏有效的治疗方法，而选育抗病品种是预防烟草普通花叶病的最经济、最有效的根本途径。

在烟草抗TMV种质资源中，应用最广泛、最具育种价值的抗性反应是烟草N基因介导的过敏性反应(hypersensitive response，HR)，其特征是携带N基因的烟草接种TMV后约48小时就发生过敏性反应，即在侵染点部位产生枯斑，TMV被限制在枯斑或其邻近部位，不能进一步扩展。N基因介导的抗病性同时具有温度敏感性，当温度在32℃以下时，携带N基因的烟草接种TMV后发生过敏性反应，而在32℃以上时，则发生系统侵染。目前几乎所有选育的高抗TMV烟草生产品种均属于这种类型。

现有烟草TMV抗性鉴定方法主要有大田自然发病鉴定、大田接种鉴定和温室苗期接种鉴定。大田自然发病鉴定和大田接种鉴定方法都易受种植条件和气候的影响，在不同地域、年份的鉴定结果往往差异较大；并且在大田环境下，容易发生多种病毒的混合侵染，最终影响鉴定结果。温室苗期接种鉴定，是目前应用较普遍的方法，但这种方法既要求条件较高，需要防虫、温度调控条件较好的温室大棚，而且所需时间长、工作量大，从播种育苗到接种鉴定调查需要2-3个月时间，期间还需要对烟苗进行精细管理。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种烟草普通花叶病抗性的离体快速鉴定方法。本发明是根据烟草对TMV的抗性特点，对烟草的TMV抗性进行鉴定，较原有的鉴定方法具有简便、快速、准确性更高、针对性更强、更适用于烟草普通花叶病抗性品种的选育工作的特点。

本发明的一种烟草普通花叶病抗性的离体快速鉴定方法，包括如下步骤：

(1)研磨感染烟草普通花叶病的病叶，将研磨后得到的汁液用PH7.0的磷酸缓冲液稀释，得到接种体；

(2)用苯骈咪唑溶液浸湿滤纸，再在器皿上平铺所述滤纸，所述苯骈咪唑溶液中苯骈咪唑的质量百分比浓度为1～3％；

(3)采集待鉴定烟草品种的叶片，叶面朝上，置于步骤(2)所述的滤纸上；

(4)将所述步骤(1)得到的接种体涂抹于所述步骤(3)的叶片上，同时设置空白对照；

(5)将所述步骤(4)的器皿放置于22～28℃的环境中，所述器皿内每天添加一次质量百分比浓度为1～3％的苯骈咪唑溶液，每次1～5ml；

(6)接种培养3～5天后，调查叶片枯斑发生情况。

优选的，所述步骤(1)为研磨感染烟草普通花叶病的病叶，将研磨后得到的汁液过滤，过滤后的汁液用PH7.0的磷酸缓冲液稀释，再加入金刚砂，得到接种体，所述金刚砂的质量体积比为10～30g/L。

优选的，所述步骤(1)中稀释后的汁液的体积百分比浓度为0.01％～10％。

优选的，所述步骤(1)中的研磨为用研钵研磨。

优选的，所述步骤(1)中的过滤用纱布过滤。

优选的，所述步骤(4)中的涂抹为使用毛笔涂抹。

优选的，所述步骤(4)中的空白对照为加入金刚砂的PH7.0磷酸缓冲液，所述金刚砂的质量体积比浓度为10～30g/L。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明简便、快速、适用性广泛。整个鉴定过程仅需3～5天时间；鉴定可以在烟草整个生育期的任何时间进行，大大拓宽了抗性鉴定的时期。

(2)技术原理明确，针对性强。利用在一定温度范围内，烟草抗病品种对TMV侵染部位形成枯斑的特点，在人工模拟环境下，使其抗性反应得到快速表达，大大提高了鉴定结果的准确性和可重复性。

(3)更适用于烟草普通花叶病抗性品种的选育工作。本发明采用叶片离体鉴定，对植株损伤小，植株可以继续生长，满足其他试验和生产目的需要。可以对单株、在当代进行选择，大大加快了品种选育进程，极大地提高了育种效率。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1

实施例1是离体叶片和幼苗人工接种鉴定结果的比较。