[发明专利]一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记

说明书

技术领域

本发明涉及利用分子生物学技术对动物进行筛选育种的领域，具 体涉及一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记。

背景技术

人和动物体都存在很多的大肠杆菌，但并不会全引起人和动物发 病，是有少数引起人和动物发病，这些能引起人和动物发病的大肠杆 菌正常情况下很少存在于健康体内，这类病原菌根据其毒力因子与发 病机制不同，可分为五类：肠毒素大肠杆菌(ETEC)，类志贺毒素 大肠杆菌(EPEC)，败血性大肠杆菌(SEPEC)及尿道致病性大肠 杆菌(UPEC)，其中前两种与动物的疾病关系最密切。

其中，肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种引起人和动物腹泻最常 见的大肠杆菌，其致病力主要由黏附于性菌毛和肠毒素两种毒力因子 构成，二者密切相关缺一不可。

黏附素性菌毛是人和动物ETEC的一类特有菌毛，因其能黏附于 宿主的大肠上皮胞，故称其为粘附素或定居因子抗原。迄今，在动物 ETEC中已发现的黏附素主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P) 和F41，其次F42和F17。

目前F4受体已从上皮细胞刷状缘、小肠膜和粘液中提取。它可 能是一种复合糖(Erickson AK，Wingohs JA，McFarland SY，et al. Indentification of two porcine brush border glycoproteins that bind the F4ac adhesin of Escherichia coli and correlation of these binding glycoproteins with the adhesive phenotype[J].Infect Immun，1992，60： 983-988.)，而Grange和Mouricout报道它可能是74kDa的转铁蛋白， 以及一种小肠中性鞘糖脂(Grange PA，Mouricout MA.Transferrin association with the porcine intestinal mucosa is a receptor specific for the F4ab fimbriae of Escherichia coli[J].Infect Immun，1996，64： 606-610.)。

粘附素虽然不是导致宿主腹泻的直接致病因子，但它是构成 ETEC感染的首要因子，ETEC必须首先粘附于宿主的大肠上皮细胞， 才能避免肠蠕动和肠液分泌的清除作用，并在肠内定居和繁殖，进而 发挥致病作用。

这些粘附素要在小肠粘膜附着，还必须在小肠粘膜上皮细胞刷状 缘有特异性受体，不同动物肠粘膜有无特异性受体是由基因控制的， 无受体的动物在受到细菌感染时不发病，表现为抗性。

目前豚鼠、蚝牛和猪等多种动物都存在ETEC致死现象，尤其是 猪，因此寻找和筛选ETFC受体的遗传标记是培育出具有抗性动物的 重要途径。

发明内容

本发明的目的是针对ETEC在动物饲养中导致泻痢的现象，提供 一种通过分子生物学技术找出ETEC粘附素F4受体的相关基因- PMCA1，并研究该PMCA1基因的多态性，从而能有效地筛选动物 抗病育种的方法。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述方法专门用于猪的抗 病育种筛选的遗传标记。

本发明的另一个目的是提供上述遗传标记在猪标记辅助选择中 的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

鉴于目前ETEC引起动物泻痢的情况在猪中最为常见，因此本发 明人选择猪作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选ETEC的粘附 素F4受体的相关基因，其步骤如下：

(1)分别采集不同品种初生仔猪的小肠，采用体外黏附测定检测 各样品的黏附性；

(2)提取小肠上皮细胞总RNA，并将之反转录成cDNA；

(3)利用δ差异显示引物实施差异PCR，采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳和银染法显示PCR产物；

(4)将差异带回收后再PCR扩增，以增加差异DNA数量；

(5)Northern blot鉴定阳性差异带；

(6)将阳性差异带克隆并测序后，将序列进行数据库同源性分析；

(7)根据测序结果和序列分析结果，筛选与受体有关的基因。