[发明专利]一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及鼻咽癌早期检测试剂盒和检测方法，特别是一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国南方和东南亚地区的常见恶性肿瘤，其发病率在15～50/10万人口。鼻咽癌的发生有多种遗传和环境因素的参与，其中Epstein-Barr病毒(EB病毒)作为一种特殊的环境致病因子，与鼻咽癌高度相关：鼻咽癌患者血清中EB病毒特异性抗体水平显著升高；EB病毒的感染发生于鼻咽癌细胞单克隆增殖之前；EB病毒DNA及其表达产物在鼻咽癌病灶中的广泛检出等，均提示EB病毒在鼻咽癌的发生发展中起着重要作用。但是EB病毒的感染在大多数人群中并不引起疾病。因此，在鼻咽癌细胞中可能存在具有转化能力的致癌性EB病毒亚株。

EBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1)是唯一在EB病毒相关肿瘤细胞中均有表达的蛋白，在病毒的潜伏性感染中有重要的功能。EBNA1可以激活EB病毒的DNA复制，在宿主细胞的分裂过程中，EBNA1蛋白可与细胞分裂中期染色体相结合，介导EB病毒游离体在子代细胞的平均分配。作为转录激活子，EBNA1可以促进其他EBNA蛋白，以及LMP1蛋白的表达。EBNA1可以分为P-ala，P-thr，V-val，V-leu和V-pro五种亚型。在广东地区患者的鼻咽癌组织中，全部为单一的V-val突变型，提示这种突变型与鼻咽癌有密切的相关性。目前还没有一种将EBNA1基因的检测用于诊断鼻咽癌中。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒。

本发明的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因EBNA1扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。

优选的，所述EBNA1扩增用基因特异性引物如下：

5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，

5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。

优选的，本发明的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为B95-8细胞DNA。

优选的，本发明的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒还包括阴性对

照，所述阴性对照为BJAB细胞DNA。

本发明的第二个目的是提供鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测方法。将待检模板DNA通过EBNA1扩增用基因特异性引物进行PCR扩增。所述EBNA1扩增用基因特异性引物如下：

5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，

5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。

本发明的第三个目的是提供了鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒

在早期诊断鼻咽癌中的应用。

同现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了一种鼻咽癌诊断试剂盒及其检测方法与应用，该试剂盒可以快速、准确地进行外周血EB病毒EBNA1亚型的检测，从而可以对鼻咽癌做出快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。作为一种无创伤性而快速的检查方法，在鼻咽癌高危人群的筛查以及鼻咽癌的早期发现和早期诊断中具有重要的临床价值。本发明的检测试剂盒和检测方法操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性和敏感性均较高，PCR检测可以批量进行，对于大规模的鼻咽癌筛查是一种有价值的指标，具有广阔的市场前景。通过检测鼻咽癌患者和EB病毒携带者外周血中EBNA1的亚型，进行统计学分析，根据EBNA1亚型与鼻咽癌的相关性，可为鼻咽癌的临床早期诊断找到新的生物标记物。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

病例选择及试验方法：

我们的随机外周血样品包括144份携带有EB病毒的健康成人外周血样品和36例鼻咽癌患者外周血标本。所有病例和对照个体均为广东地区居民操白话方言者。144例健康人中男性79例，女性65例，平均年龄为41.62岁(年龄范围20～82岁)。36例鼻咽癌患者均经CT和病理确诊，其中男性26例，女性10例，平均年龄为48.4岁(年龄范围29～74岁)。其中临床分期为I期者1例，II期6例，III期12例，IV期17例。病理诊断为未分化型非角化鳞状细胞癌者32例，分化型非角化鳞状细胞癌者4例。