[发明专利]构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法。

背景技术：

尿道下裂发病因素繁多，机制复杂，遗传因素是尿道下裂发生的一个 原因，但近年来环境中内分泌干扰性化学物质的增多，特别是雌激素摄入 的增多被认为是尿道下裂发病率增加的一个关键因素，我们已经成功建立 了雌激素诱导的尿道下裂动物模型，研究一些内分泌干扰化学物质与阴茎 发育之间的关系，特别是揭示其中的机制对尿道下裂的防治至关重要，但 在研究阴茎发育时目前缺乏相关的工具，动物模型研究虽然有效但不方便， 小鼠阴茎的发育与人类相似，我们在研究中发现小鼠生殖结节发育在性分 化期(E14.5d)前小于1mm³，适于器官培养。我们设想通过生殖结节在体 外进行器官培养建立尿道体外发育模型，为进一步研究阴茎尿道发育机制 和外生殖器畸形的发病机制提供有效工具。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种方法合理，易操作的构建生殖结节器官培 养尿道体外发育模型的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：依 次包括下列步骤：

(1)精确孕期小鼠的获取：取8-10周龄近交系小鼠，于晚上按雌雄4∶1 合笼，第二天早上分笼，分笼时观察雌鼠阴道内阴栓情况，以阴道口看见 白色浆液性栓子者为交配成功，予以分开饲养，定为孕0.5d计算，交配未 成功者可予以再交配；

(2)胚胎性别鉴定：采用解剖法或PCR法进行性别鉴定；

(3)生殖结节的切取和培养：

①断颈处死孕鼠，将其固定于取材板上，75％酒精消毒皮肤，剖开腹 部及子宫，取出胎鼠放入培养皿中；

②解剖显微镜下寻找到生殖结节，于其根部用膜状内障剪迅速剪下， 将离体生殖结节迅速转移至培养液中；

③将-CM插入式细胞培养皿预先放入BGJB培养液中37℃浸 泡30分钟，然后在6孔板中每孔加培养液1.1ml，放入-CM板；

④将待培养的生殖结节放置于-CM板的微孔膜上，保留生殖 结节表面的液膜；

⑤每块-CM板的微孔膜上均匀放置4～5枚生殖结节；

⑥将6孔板放入CO₂培养箱中，24小时换液一次，每次换液注意调节 液面，使得生殖结节一直处于气液相交界处；

⑦培养分组：将生殖结节分成加生理浓度10nM DHT的DHT组及不加 DHT的无DHT组；

(4)培养生殖结节的鉴定：采用生殖结节培养前后形态和大小测量方 法、生殖结节激光共聚焦三维成像方法、生殖结节冰冻切片HE染色法中至 少一种进行鉴定。

步骤(2)中的解剖法包括下列步骤：小鼠胚胎腹部取大十字切口，切 开后去除腹腔内容物，显示后腹腔，于肾脏下方，膀胱外上方寻找性腺， 睾丸为微小球形，边缘有附睾附着，并与输精管相连，下方有睾丸引带附 着，卵巢为一细线形的组织；有睾丸者为雄性胚胎，未找到睾丸或找到卵 巢者为雌性。

步骤(2)中的PCR法包括下列步骤：

①PCR扩增对象：小鼠胚胎肝脏；

②常规基因组DNA提取：

③PCR检测

a、引物设计：SRY(雄性性别决定基因)：上游引物：5′- ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3′，下游引物：5′-CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3′， 内参：GAPDH，上游引物：5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3′，下游引5′- ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3′。

b、反应体系：

取PCR反应专用的0.25ml薄壁EP(德国Eppendorf公司简称)管，按 下列顺序加入各试剂：10×反应缓冲液2.0μl；25mmol/L  MgCl₂2μl； 2.5mmol/L dNTPs 0.5μl；25pmol/μL SRY基因上下游引物各0.8μl；25pmol/μL GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)上下游引物各0.8μl；5u/μl Taq酶 0.25μl；模板DNA 1μl；加无菌去离子水11.05μl至20μl，，溶液混合均匀， 4℃下离心，使溶液沉于管底；