[发明专利]构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法

权利要求书

1.一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特 征是：包括下列步骤：

(1)精确孕期小鼠的获取：取8-10周龄近交系小鼠，于晚上按 雌雄4∶1合笼，第二天早上分笼，分笼时观察雌鼠阴道内阴栓情况， 以阴道口看见白色浆液性栓子者为交配成功，予以分开饲养，定为孕 0.5d计算，交配未成功者可予以再交配；

(2)胚胎性别鉴定：采用处死后解剖法或PCR法进行性别鉴定；

(3)生殖结节的切取和培养：

①断颈处死孕鼠，将其固定于取材板上，75％酒精消毒皮肤，剖 开腹部及子宫，取出胎鼠放入培养皿中；

②解剖显微镜下寻找到生殖结节，于其根部用膜状内障剪迅速 剪下，将离体生殖结节迅速转移至培养液中；

③将-CM插入式细胞培养皿预先放入BGJB培养液中 37℃浸泡30分钟，然后在6孔板中每孔加培养液1.1ml，放入 -CM板；

④将待培养的生殖结节放置于-CM板的微孔膜上，保 留生殖结节表面的液膜；

⑤每块-CM板的微孔膜上均匀放置4～5枚生殖结节；

⑥将6孔板放入CO₂培养箱中，24小时换液一次，每次换液注 意调节液面，使得生殖结节一直处于气液相交界处；

⑦培养分组：将生殖结节分成加生理浓度10nM DHT的DHT组 及不加DHT的无DHT组；

(4)培养生殖结节的鉴定：采用生殖结节培养前后形态和大小 测量方法、生殖结节激光共聚焦三维成像方法、生殖结节冰冻切片 HE染色法中至少一种进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育 模型的方法，其特征是：步骤(2)中的解剖法包括下列步骤：小鼠 胚胎腹部取大十字切口，切开后去除腹腔内容物，显示后腹腔，于肾 脏下方，膀胱外上方寻找性腺，睾丸为微小球形，边缘有附睾附着， 并与输精管相连，下方有睾丸引带附着，卵巢为一细线形的组织；有 睾丸者为雄性胚胎，未找到睾丸或找到卵巢者为雌性。

3.根据权利要求1所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育 模型的方法，其特征是：步骤(2)中的PCR法包括下列步骤：

①PCR扩增对象：小鼠胚胎肝脏；

②常规提取基因组DNA

③PCR检测

a、引物设计：SRY：上游引物：5′-ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3′， 下游引物：5′-CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3′，内参：GAPDH，上游引 物：5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3′，下游引5′- ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3′；

b、反应体系：

取PCR反应专用的0.25ml薄壁管，按下列顺序加入各试剂：10×反 应缓冲液2.0μl；25mmol/L MgCl₂2μl；2.5mmol/L dNTPs 0.5μl； 25pmol/μL SRY基因上下游引物各0.8μl；25pmol/μL甘油醛-3-磷酸 脱氢酶基因上下游引物各0.8μl；5u/μl Taq酶0.25μl；模板DNA 1μl； 加无菌去离子水11.05μl至20μl，，溶液混合均匀，4℃下离心，使溶 液沉于管底；

c、扩增程序：按下列程序在PCR扩增仪上操作，94℃4min预变 性，然后94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸15秒，共35 次循环，最后72℃延伸5min后终止扩增；

d、称取琼脂糖1.2g，加入10倍电泳缓冲液10ml，再加入蒸馏 水90ml，在电炉上加热溶解，配制成1.2％琼脂糖凝胶；稍凉后加入 配好的EB溶液2滴；

e、将电泳模板两端密封，倒入琼脂糖凝胶溶液，插入梳子，冷 凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中；

f、加样：取样品溶液10μl，加入1/5体积加样缓冲液，混匀后， 将溶液加到样品孔中，同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。 一般DNA样品最好控制在0.5～1.0μg之间。

g、电泳：加入1×Tris-乙酸缓冲液，通电维持80V，电泳至溴 酚蓝走到胶中后1/3处停止电泳；

h、染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其推到一块干净 的玻璃板上，于254nm或300nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位 置呈现橙黄色荧光，即时拍照；

④结果的判定

170bp为内参GAPDH，122bp为SRY基因，内参阳性者为扩增 有效，SRY阳性为雄性，阴性为雌性。