[发明专利]手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种液相芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于分子生物学技术及临床检测技术领域。

(二)背景技术

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)又名发疹性口腔炎，是由肠道病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征的一种急性常见传染病。儿童多发，3岁及3岁以下婴幼儿更容易得病。HFMD传染性强，传播途径复杂，传播快，在短时间内即可造成大流行。

引起HFMD的病原体主要为微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组的2、4、5、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CA16)与肠道病毒71型(EV71)。不同型别肠道病毒感染导致的HFMD病情也各不相同。与CA16和ECHO等肠道病毒相比，EV71型引起的HFMD重症感染的比例较大，可引起脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、疱疹性咽峡炎、神经源性肺水肿、肺出血、病毒性心肌炎等多种疾病。重症患儿病死率可达10％至25％。

目前HFMD实验室诊断常用方法为血清学中和实验，病原学细胞接种，分子生物学逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或real-time RT-PCR(rRT-PCR)等，这些方法一次只能检测一种病毒，在实际应用过程中对于病毒谱的检测既繁琐又需要相对大量的试剂和临床标本，检测费用高，因此如果能运用新的技术将这些病毒进行同时检测，将会对这一类疾病的诊疗提供极大的方便。目前日益成熟的生物芯片技术的高通量的特点可以实现多种病毒的一次性的联合检测。液相芯片技术是生物芯片的一种，它除了具有普通生物芯片(即固相芯片)高通量的特点外，还具有固相芯片不具有的高稳定性、高敏感性等优点，因此手足口病相关病毒平行检测液相芯片的研制和开发迎合了目前实验室和临床诊断的需要。

(三)发明内容

根据引发手足口病相关病毒多样化的特点，针对目前手足口病检测采用的ELISA、RT-PCR和real-time RT-PCR等方法一次只能检测一种病毒技术的不便、繁琐费时和实验室及临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用，不仅可以同时检测引发手足口病的多种病毒，而且检测迅速，准确，省时省力，有利于实现手足口病的早发现、早诊断和早治疗。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的手足口病相关病毒平行检测液相芯片，主要由微球，特异性探针，生物素化的通用引物，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是26、36和46号微球；所述特异性探针是针对EV71、CoxA16和Echo9病毒VP1区域的氨基化的特异性探针，通用引物是经活化的生物素标记的肠道病毒通用引物。

其中：所述EV71特异性探针与26号微球形成偶联体，CoxA16特异性探针与36号微球形成偶联体，Echo9特异性探针与46号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。

以红色激光激发球形基质上的红色分类荧光，依据球形基质的色彩不同确定类型；所述通用引物的生物素标记与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的手足口病相关病毒核酸的的含量。

本发明共确定了3种用于手足口病诊断的针对VP1区域的特异性的探针，并利用所述探针分别检测其相应的病毒核酸，分别是：EV71病毒核酸、CoxA16病毒核酸和Echo9病毒核酸。本发明所涉及的3种针对手足口病相关病毒VP1区域的特异性探针，是在大量临床应用的基础上，证实确与手足口病的发生有密切关系而选择的。

优选的，所述生物素化的通用引物是：经过活化生物素标记的针对肠道病毒的通用引物。

优选的，所述26、36和46号微球是经洗涤、活化的羧基微球。

生物素化的通用引物用于扩增手足口病相关病毒核酸，同时将扩增的RT-PCR产物标记上生物素，生物素标记可以将与液相芯片微球体结合的RT-PCR产物与检测荧光偶联，间接将结合的RT-PCR产物的浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对每种病毒的浓度进行定量测定。