[发明专利]产β-1,3-葡聚糖酶的微生物及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生β-1，3-葡聚糖酶的微生物及其菌体发酵培养粗酶制剂的制备方法与应用，属于生物技术领域。

技术背景

β-葡聚糖在自然界中分布广泛，是组成高等植物、酵母菌和丝状真菌细胞壁的结构大分子之一。β-葡聚糖广泛存在于麦类作物中，主要结构是β-1，3-1，4-葡聚糖。酵母细胞壁中多糖含量为85-90％，其主要成分是β-1，6-分枝的β-1，3-葡聚糖。酵母细胞壁是β-1，3-葡聚糖的重要来源。很多重要的植物病原真菌细胞壁的主要成份也是β-1，3-葡聚糖，它同几丁质一起构成真菌细胞壁的网状骨架。

β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucanase，EC3.2.1.39)是一类能特异作用于葡聚糖中的β-1，3-糖苷键的水解酶，可以催化β-1，3-葡聚糖的水解反应。β-1，3-葡聚糖酶可广泛应用于啤酒工业、饲料工业、生物防治以及医药等领域。在饲料、啤酒等行业中，β-葡聚糖是限制麦类有效利用的关键因素，β-1，3-葡聚糖酶能够有效分解麦类植物细胞壁中的葡聚糖，显著降低饲料中非淀粉多糖的含量，降低啤酒酿造中麦芽汁的黏度，提高麦芽溶出率，稳定啤酒质量。β-1，3-葡聚糖酶能破坏真菌的细胞壁，可用于抑制有害真菌的生长与增殖，是重要的抗真菌病的物质。β-1，3-葡聚糖酶能够降解酵母细胞壁，从而促进酵母细胞内容物的释放和利用。β-1，3-葡聚糖具有抗肿瘤和免疫调节等药理活性，其生物活性与葡聚糖的分子量和水溶性相关。β-1，3-葡聚糖酶能增加葡聚糖的水溶性，用于可溶性免疫多糖的制备。

β-1，3-葡聚糖酶来源广泛，某些植物、真菌和细菌均能产生。在细菌中，目前已发现的β-1，3-葡聚糖酶的产生菌主要是芽孢杆菌，其他β-1，3-葡聚糖酶产生菌研究得非常少。筛选新的β-1，3-葡聚糖酶产生菌，对获得具有优良性状的β-1，3-葡聚糖酶，促进葡聚糖酶的广泛应用有重要意义。本发明筛选的β-1，3-葡聚糖酶产生菌为壳聚糖酶产生菌(Mitsuaria chitosanitabida)，在分类系统中，该菌所在的属和种都是2005年刚定名的新属和新种(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55，1927-1932)。目前仅有几篇论文报道壳聚糖酶产生菌能产生壳聚糖酶，尚没有关于该菌产生β-1，3-葡聚糖酶的报道。

发明内容

针对现有β-1，3-葡聚糖酶产生细菌来源不足的缺陷，本发明提供一种产β-1，3-葡聚糖酶的微生物与用途。

本发明的产β-1，3-葡聚糖酶的微生物是壳聚糖酶产生菌H12。

本发明的产β-1，3-葡聚糖酶的微生物分类命名为壳聚糖酶产生菌H12(Mitsuariachitosanitabida H12)，其保藏号为CGMCC 2949，保藏日期为2009年3月13日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。其16SrRNA基因序列如Seq.No1所示。

本发明的壳聚糖酶产生菌H12的分离筛选步骤如下：

土样采于趵突泉啤酒厂，将土样点种于筛选培养基上，30℃培养3天，挑取降解酵母细胞壁透明圈大的菌落边缘，再次转接到筛选培养基上，30℃培养3天，挑取降解酵母细胞壁透明圈边缘的菌体，进行平板划线分离，得到菌落纯的壳聚糖酶产生菌H12。

所用筛选培养基为：安琪酵母5.0g，CaCl₂.2H₂O 1.36g，琼脂10g，加水至1L，121℃灭菌30min。

本发明的壳聚糖酶产生菌H12菌株特征如下：

壳聚糖酶产生菌H12经菌株鉴定为壳聚糖酶产生菌(Mitsuaria chitosanitabida)，其16S rRNA序列见基因序列表，与Matsuenia chitosanotabidus(ATCC保藏号：BAA-476^TM)的16S rRNA序列相似性为98.9％。该壳聚糖酶产生菌H12能以酵母细胞壁为唯一碳源生长，在酵母平板上生长迅速，形成明显的菌落。菌落呈乳白色，菌落边缘整齐，菌落周围有降解透明圈产生。显微镜观察细胞呈短杆状，两端稍尖，无鞭毛，不运动，菌的大小宽约0.8-1μm，长约2.5-3.0μm，革兰氏染色为阴性。

本发明的壳聚糖酶产生菌H12制备β-1，3-葡聚糖酶的用途，用壳聚糖酶产生菌H12菌体发酵培养粗酶液制备β-1，3-葡聚糖酶粗酶制剂。

上述壳聚糖酶产生菌H12菌体发酵培养粗酶液的制备方法包括如下步骤：