[发明专利]一种双色竞争性荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种双色竞争性荧光定量聚合酶链反应(dual color competitivefluorescence quantitative polymerase chain reaction，DCC-FQ-PCR)检测试剂盒，具体是涉及一种21号染色体倍性检测的双色荧光定量聚合酶链反应体外竞争性PCR试剂盒，属于分子生物学检测诊断领域。 

背景技术

唐氏综合征(Down Syndrome，DS)，又称为先天愚型，是活产胎儿中最常见的染色体异常综合征之一，其发病率约为1/600-1/800。DS的体征非常多样，通常涉及多种组织器官的异常，但其最突出、最严重的临床表现为精神发育迟滞。该病的主要临床特征为：严重智力低下，且智力低下的表型随年龄增长逐渐明显，动作发育和性发育迟缓，基本无生活自理能力。具有独特的面部和身体畸形、先天性心脏病、消化道畸形等，白血病的发病率也比人群平均发病率高10-30倍。患者的平均寿命在30岁左右。 

DS绝大多数都是偶发的，每个孕妇都有生患儿的可能，发病无明显的种族差异和家族聚积现象。世界各地大量群体调查的结果表明种族之间发病率几乎相同，唐氏综合征的每个体细胞中21号染色体为3条，而其它常染色体为2条，淋巴母细胞或羊水脱落细胞体外培养和染色体制备观察是其实验室检测的常规方法，该方法虽然准确度高，但技术复杂耗时长，不能实现自动化和高通量检测。由于唐氏综合征患者21号染色体上的单拷贝序列拷贝数是其它常染色体上的单拷贝序列拷贝数的1.5倍，而DSCR是唐氏综合征发病的关键单拷贝序列区段，因此可以选择21号染色体上的DSCR特异的单拷贝序列和常染色体上的特异单拷贝序列，通过荧光定量PCR技术来检测出它们的相对拷贝数的比值来判断21号染色体的倍性，从而对从微量DNA标本中检测出唐氏综合征具有重要现实意义。 

实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的能够对特异DNA(基因)拷贝数进行精确定量的最先进的基因剂量定量新技术。其基本原理是在PCR反应体系中同时加入TaqMan 探针(特异寡核苷酸探针)，该探针的5’端标记了一条荧光报告基团(R)，而在这条寡核苷酸探针的3’端标记了一条荧光淬灭基团(Q)。当这条探针处于完整状态或者没有反应时，R所产生的一部分荧光将被Q吸收或淬灭。在PCR反应过程中，该探针可与PCR目标基因特异性杂交，然后被Taq DNA聚合酶的5’外切活性降解，使R和Q分离，游离的R发出荧光信号被检测。随着PCR反应的进行，游离的R与PCR产物相对应的增加。因此，根据每个循环后R产生的荧光信号的强度，即可实时测量出PCR反应产物的数量。如果同时使用拷贝数已知的DNA标准品做标准曲线，即可对所检测的标本的靶DNA做精确定量。 

发明内容

本发明目的在于建立一种操作简便，能够快速准确检测唐氏综合征患者的DCC-FQ-PCR试剂盒。 

本发明的技术方案是：该种DCC-FQ-PCR试剂盒，含有扩增21号染色体特异单拷贝区段DSCR和2号染色体特异单拷贝序列USC2的荧光定量PCR试剂，其特征在于，首先根据21号染色体特异序列DSCR区段序列和2号染色体上的与之有一定的同源性的特异单拷贝序列USC2分别合成其共用PCR引物和特异性双色Taqman荧光探针，然后将0.2-0.4umol/LDSCR和USC2共用特异性引物、DSCR和USC2特异双色荧光Taqman探针加入同一个PCR扩增缓冲反应体系中，在FTC2000实时荧光定量PCR仪上进行96℃预变性2min，然后94℃变性10sec，50-55℃复性30sec，60℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时检测荧光强度，使引物分别同时竞争性地引导DSCR和USC2两种特异单拷贝DNA区段的新链合成，实现DCC-FQ-PCR扩增和其拷贝数的定量检测。 

上述DSCR和USC2共用引物和特异双色Taqman荧光探针的序列分别为：共用上游引物5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G-3’(SEQ ID NO：1)；共用下游引物：5’-TCCTCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’(SEQ ID NO：2)；DSCR TaqMan探针：5’-[FAM]ACA TTTTGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)；USC2特异TaqMan探针：5’-[HEX]CAA AAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：4)。