[发明专利]一种抗菌肽及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种抗菌肽及其构建和应用。

背景技术

血蓝蛋白(hemocyanin)是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼 吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色。

一般认为，血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关，它与血 红蛋白(hemoglobins)和蚯蚓血红蛋白(hemerythreins)并称为动物界3种 呼吸蛋白。近年来研究表明，血蓝蛋白不仅具有输氧功能，而且还与能量 的贮存、渗透压的维持、蜕皮过程的调节、表皮的固化以及黑色素的合成 有关。特别引起学术界重视的是，血蓝蛋白及其降解片段还具有酚氧化物 酶活性、抗病毒和抗菌等多种免疫学功能，被认为是一种具有多种非特异 性免疫活性的多功能蛋白。

血蓝蛋白是一种多功能蛋白，它不仅具有输氧功能，而且还具有免疫 防御功能。血蓝蛋白具有细菌凝集活性；血蓝蛋白可部分降解产生具有抗 菌功能的抗菌蛋白和抗菌肽；血蓝蛋白具有非特异性抗病毒作用；血蓝蛋 白在一些化学试剂，生物防御分子，以及血细胞组成成分的作用下可表现 出类似于酚氧化酶的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌肽及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

抗菌肽的序列由序列表SEQ No.1中核苷酸所示。所述抗菌肽所编码基 因由序列表SEQ No.2中氨基酸所示。

抗菌肽的构建方法：以中国名对虾肝胰腺cDNA为模板，再以中国名对 虾中的血蓝蛋白基因为模板设计的引物xueNF和xueXR进行PCR扩增，所 得产物即为由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的序列；

引物序列为：xueNF：5’ATGACGCCATGTTTGAAGTCCTTCCCAAC3’，xueXR： 5’TTCTACTCGAGTATGGTGATGGATATGTTC 3’。

所述得到中国名对虾肝胰腺cDNA时所获得的中国明对虾肝胰腺总RNA 需将加入RNase-free水后于室温放置0.5-1h使RNA充分溶解。

所述中国名对虾中的血蓝蛋白，以肝胰腺cDNA作为模板，用引物Xues1 和Xuea1进行PCR扩增，即得到血蓝蛋白部分cDNA片段；而后根据产物的 序列再设计正向引物XueRace3-1和XueRace3-2引物，反向引物XueRace5-1 和XueRace5-2引物，而后利用四条引物并以肝胰腺cDNA作为模板进行RACE 扩增，将扩增产物序列进行拼接，即得到血蓝蛋白cDNA全长序列；

引物序列为：Xues1为5’CCTCGGTGTTTGTGATGG3’；Xuea1为5’ ATTTCAACGGGCGGTCTG 3’，XueRace3-1为5’GTCAGTTCCCCTCTCGTCCAGATAATG 3’；XueRace3-2为5’AGGATGTGGATGGTGTTGCTCG 3’；XueRace5-1为5’ ATGCGAGCAACACCATCCACATCCT3’；XueRace5-2为 5’CATTATCTGGACGAGAGGGGAACTGAC 3’。

抗菌肽的应用：所述由序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽经 重组表达后纯化的重组表达抗菌肽对多种病原微生物具有拮抗活性作用； 同时所述由序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽的导入水稻基因 组，其对水稻纹枯病和稻瘟病具有抗性，并且转基因水稻的秸秆和稻糠可 用于饲料中。

由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的抗菌肽，用限制性内切酶NcoI和 XhoI进行双酶切，与经过同样酶切的质粒pET-32a的DNA在T4 DNA连接酶 作用下进行拼接的质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，将其在含有氨苄青 霉素的LB培养基中于37℃震荡培养16h后，待菌体OD达到0.6-1.0时， 加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导表达，收集菌体，用超声波破碎细胞，离 心后上清为重组抗菌肽的粗产物，经过His-Tag亲和层析，即为经重组表 达后纯化的重组表达序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽。