[发明专利]猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽医生物技术领域的诊断技术，具体地说是猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，已广泛受到了人们的重视。随着对PCV2及其致病性的研究的深入，近来发现PCV2还与猪的繁殖障碍、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、皮炎与肾病综合征(porcine dermatisand nephropathy syndrome，PDNS)、幼龄仔猪的先天性震颤等疾病有关。近年来，我国规模化猪场PCV2感染以及由此引起的疾病愈来愈普遍，给我国养猪生产造成了较大的经济损失。

目前，公知的猪圆环病毒2型抗体快速检测试剂盒(ELISA法)，系采用酶联免疫技术检测样品(血清)中猪圆环病毒2型抗体的方法。即：采用猪圆环病毒2型经纯化、浓缩制成的抗原包被微孔板，在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪圆环病毒2型特异性抗体，则将与微孔板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与微孔板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB或OPD底物液，与酶反应形成有色产物，加入终止液反应后，用酶标仪固定波长(450nm或630nm)测定各反应孔中的OD值。ELISA适合大批样品的检测，成为了一种常规的检测方法。但是，该方法抗原的制备过程必须经过病毒的细胞培养、病毒纯化等繁琐模式，特异性不高、稳定性差，而且成本高；检测时需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，检测操作人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂；检测所需要时间比较长；检测所需费用高。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法。

本发明的目的是针对目前我国猪圆环病毒病普遍存在，给养猪业带来严重经济损失及缺乏现场操作简便的试剂盒的现状，提供一种提供一种不需要特定仪器设备辅助的检测试剂，并能有效地降低检测成本，能够应用于大规模现地检样的诊断方法。

本发明的猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法是通过以下技术方案实现的：

利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成快速检测猪血液或血清中的抗体。猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维膜(NCM)和吸水垫和PVC板。按照正确地顺序固定在PVC板上。PVC板一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫包被了基因工程表达的猪圆环病毒2型ORF2蛋白-胶体金结合物，将表达蛋白包被在硝酸纤维膜作为检测线(T)，将兔抗猪圆环病毒2型抗体包被在硝酸纤维膜作为对照线(C)。可广泛用于临床猪圆环病毒病的检测。与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为98.63％和95.83％，整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

一、基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白制备

1材料和方法：

1.2ORF2基因氨基端(737-421nt)的扩增

参照PCV2JXL序列，设计并合成1对引物，以重组质粒pMDT-PCV为模板，扩增ORF2基因的氨基端(737-421nt)部分片段。

CapL 5’ AGC AAG CTT CTT TCG TTT TC3’，

PCVF 5’GGG AAT TCA ACC TTA ATC TTC CTT A 3’

上游引物下划线为HindIII序列，核酸位置739nt；下游引物下划线为EcoRI序列，位于423nt。

PCR反应条件为，94℃热启动5分钟，94℃变性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分钟。扩增产物即为PCV_737-421，经1％琼脂糖电泳。

1.2ORF2基因氨基端片段在pMD-18T中的克隆