[发明专利]用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法。

背景技术

大麦和酵母是啤酒制造的主要原料，大麦对酵母的影响一直是人们研究的 热点，大麦中抗菌蛋白对酵母的毒害作用一直受人们的关注。Okada(1970)等从 小麦和大麦中分离了一种对酵母有毒性的物质。它是一种抗蛋白水解和抗热的 多肽，但在二价钙离子存在的条件下，其对酵母的影响会减弱，提到用0.05M的 硫酸浸提大麦得到的蛋白对酵母有毒害作用的物质；有抗菌素，非特异脂移蛋白、 硫堇等，他的提取方法工艺复杂，提取时间较长。Barry C.Axcell(2000)提出提 出不彻底发酵现象与对酵母毒害作用可能是相互联系的，而且主要的原因可能 是脂类转移蛋白的抗菌多肽或硫堇类，并提出能部分提纯这种蛋白。Sandra N.E.van Nierop(2008)采用0.05M硫酸提取后，直接用透析袋透析，后冷冻干燥， 加乙腈去除不容物。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种用大麦麦芽制备抗 菌蛋白的方法。本发明通过高效提取大麦芽蛋白，硫酸铵分级沉淀抗菌活性物 质，当抗菌蛋白含量在31ug/ml时，培养8h-12h后，酵母生长抑制率达到了30％， 乳酸菌抑制率达到了50％。具有工艺操作简便，生产成本低，所得抗菌活性物 质活性稳定。

本发明的大麦或绿麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，包括如下步骤：

第一步、将大麦麦芽粉碎后，将麦芽粉末与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰 浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15分钟搅拌一次，8000r/min离心10分钟， 取上清液，用氢氧化钠调到6.5～7.0，得到抗菌蛋白的粗提液；

第二步、将抗菌蛋白的粗提液加入硫酸铵至饱和度达到30％，在4℃， 10000r/min，离心10min后，去沉淀，上清液加入80％硫酸铵，在4℃，10000r/min 离心10分钟后弃去上清液，将沉淀用水复溶；

第三步、将上述复溶物加到精密排阻1000Da的透析袋中，透析至所得蛋白液用 氯化钡检测无硫酸根离子，将上述蛋白液离心得上清液，冷冻干燥，加入乙腈 水溶液复溶，离心弃除不容物，用0.45微米纤维滤膜过滤后即得抗菌蛋白液， 其中乙腈水溶液为乙腈∶水＝1∶3～5。

本发明可选用大麦粒、麦芽或经5天发芽的绿麦芽，将其粉碎后直接与 0.05M硫酸混合，优选方法为将上述粉末过40～80目筛后再与0.05M硫酸混合。

抑制率测定方法：抑制率＝(OD_空-OD_样)/OD_空，OD_样即把抗菌蛋白加入 菌培养液中在600nm下所得吸光值，OD_空即是把等体积乙腈水溶液加入菌培养 液中在600nm下所得吸光值。  

本发明与现有技术相比，具有如下优点：采用0.05M硫酸提取抗菌蛋白， 利用抗菌蛋白的稳定性使杂蛋白酸解，提高了提取率，采用了硫酸铵分级沉淀， 大大纯化了抗菌蛋白的纯度，通过排阻1000Da的透析袋，透析出去了硫酸根离 子，使小分子的抗菌多肽得以保留，利用乙腈水溶液，使不溶的杂蛋白分离出 去，所得抗菌蛋白的含量在31ug/ml，培养8小时，酵母抑制率达到30％，乳酸菌 抑制率达到了50％。本发明操作简便，生产成本低。

具体实施方式

实施例1

第一步：将绿麦芽粉碎后，取50目粉末与0.05M硫酸以1∶6混合，冰浴 浸提3小时，中间每隔15min搅拌一次，提取结束后，在4℃，8000r/min，离心 10min，除去沉淀，上清用0.5M氢氧化钠调Ph值为7.0。

第二步：将上清加入硫酸铵使饱和度达到30％，放置两个小时后，在4℃， 10000r/min，离心10min，除去沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，在4℃， 10000r/min，离心10min，除去上清，用少量去离子水复溶沉淀得抗菌蛋白液。

第三步：将水复溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，用去离子水 透析过夜，至无硫酸根离子(用氯化钡检测)，在4℃，10000r/min，离心10min， 去除沉淀，将上清液冷冻干燥，再加入4倍体积的乙腈水溶液(乙腈∶水＝1∶4)， 在4℃放置一个小时后10000r/min，离心10min去除沉淀，保留上清液。