[发明专利]选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽

说明书

发明主题

本发明涉及通过使特定蛋白/肽标记方案与待分析的翻译后修饰的蛋白和/或肽的特异性选择进行组合，从复杂样品中选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽，其中所述翻译后修饰是糖基化。

发明背景

从复杂样品中鉴定、分离和分析特定蛋白或蛋白亚组对于揭示生物过程如何在分子水平上发生、或者蛋白在各种细胞类型中或在生理状态之间差异到何种程度是非常有价值的。

现代生物学中的主要挑战涉及由生物编码的整个蛋白组的表达、功能和调节的理解，即通常称为蛋白组学的技术领域。然而，因为不存在扩增蛋白的可能性，所以这个领域中的研究一般是相当费力的，因为即使相对简单的原核生物的细胞提取物也包含包括巨大浓度范围的多种蛋白。因此，此种任务超出任何目前简单分析法的能力。

因此，由于方法学限制，蛋白组分析不仅依赖于用于鉴定且定量蛋白的方法，还在相当大的程度上也依赖于根据其结构和/或功能性质允许其精确和可靠分离的方法，其中这些亚组随后更易于进一步分析。

蛋白组具有动态性质，响应细胞环境中的外界刺激或改变而具有蛋白合成、激活和/或翻译后修饰的改变。因此，蛋白组的固有复杂性超过细胞的基因组或转录组mRNA互补序列的复杂性。

由于在此种蛋白组学研究中待处理的非常大量的数据，所以蛋白/肽鉴定过程需要巨大的分辨能力。通常用于分辨此种高度复杂混合物的两种方法是二维凝胶电泳(2D-GE；参见例如，O′Farrell，P.H.(1975)J.Biol.Chem.250，4007-4021)和(二维)液相层析((2D)-LC；参见例如，Lipton，M.S.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，11049-11054)。通过2D-GE或2D-LC分离的肽和蛋白通常通过质谱法或通过测定氨基酸组成和/或氨基酸序列进行鉴定。

然而，尽管对于许多应用有用，但这些鉴定技术在要研究高度复杂样品的蛋白质组学研究方面具有主要缺点。例如，疏水膜蛋白质、高度碱性或酸性蛋白质、非常大或非常小的蛋白质通常经由2D-GE弱分辨。此外，这些方法的检测(灵敏度)限制以及标记技术中的缺陷不允许平行可靠分析多种样品，例如用于比较不同疾病组、疾病的不同进展阶段之间，或疾病状态与健康对照之间的相对蛋白水平或用于执行高通量筛选分析。

因此，高度希望开发克服上述局限性并且使得能够平行处理多种复杂样品的方法。

一般而言，特别是蛋白组学中，蛋白分析的另一个重要方面涉及研究翻译后蛋白修饰的可能性，翻译后蛋白修饰可以影响蛋白的活性和结合并且改变其在细胞内的作用(参见例如，Pandey，A.和Mann，M.(2000)Nature 405，837-846)。例如，蛋白的(可逆)磷酸化对于调节许多信号转导级联例如G蛋白偶联的受体信号传递或磷酸-酪氨酸激酶信号传递是关键的，蛋白糖基化在多细胞生物中的细胞/细胞和细胞/底物识别中起决定性作用，而遍在蛋白化对蛋白进行标记从而进行降解，等等。

蛋白组学的独特特征之一是翻译后修饰可以在较总体的水平上进行研究，因此允许分析包括特定修饰的整个蛋白亚组。单一基因的表达产物代表可能包含大量微异质性的蛋白群体，每个不同状态(即在翻译后修饰的氨基酸残基数目方面不同的类似蛋白)对那种蛋白的表达概况增加大量多样性。

目前，存在几种可用的技术，例如质谱法，由于特定修饰的存在或不存在，其在原则上可以区分类似蛋白或肽。然而，由于有限的检测灵敏度，这些改变通常在总体蛋白组学研究中未观察到。因此，为了研究特定翻译后修饰，通常通过某些形式的亲和纯化而针对该修饰富集样品和/或从该样品中分离富集的经修饰的蛋白亚组将是有用的。然而，可用方法一般受用合适亲和标记物标记蛋白的需求或需要使用可能干扰进一步分析的特异性抗体或其他试剂的阻遏。因此，基于亲和纯化的此种方法特别不适合于平行处理多种样品。

此外，基于捕获或亲和纯化方案来区分具有特定修饰的不同亚组的蛋白和/或肽(例如，酪氨酸磷酸化的与丝氨酸/苏氨酸磷酸化的蛋白或N-连接的糖蛋白与O-连接的糖蛋白与糖基磷脂酰肌醇-锚着的蛋白)一般是麻烦的。

蛋白糖基化的研究近年来已指数增长，这是由于来自各个学科的研究者已认识到，关键细胞功能受到此种类型的遍在翻译后修饰类型的调节。