[发明专利]经修饰的人因子VII/VIIa和包含它的药物组合物

说明书

技术领域

本发明的领域涉及要用作药物活性剂的人因子VII(FVII)/活化的因子VII(FVIIa)的制备。本发明更具体地涉及具有高稳定性的经修饰的因子VII/VIIa，编码这类经修饰的FVII/VIIa的核酸，及其制备方法。

现有技术

因子VII(FVII)是维生素K依赖性的糖蛋白，其在活化形式(FVIIa)下在存在钙和组织因子时通过活化因子X和因子IX，参与凝固过程。FVII以具有406个氨基酸残基的单肽链形式分泌，其分子量约为50kDa。FVII包含四个不同的结构域：N-端γ-羧基结构域(Gla)、两个表皮生长因子样结构域(EGF-样)，以及丝氨酸蛋白酶结构域。FVII到FVIIa的活化的特征是Arg152-Ile153键(精氨酸152-异亮氨酸153)的切割。因此，FVIIa由分子量约20kDa的152个氨基酸的轻链和分子量约30kDa的254个氨基酸的重链组成，所述轻链和重链通过单个二硫键(半胱氨酸135-半胱氨酸262)结合在一起。

FVII/VIIa被用于治疗患有血友病并遭受因子VIII缺乏(A型血友病)或因子IX缺乏(B型血友病)的患者，以及患有其他凝固因子缺陷(例如可遗传的FVII缺陷)的患者。FVII/VIIa还被推荐用于治疗脑血管意外。

获得FVIIa浓缩物的最古老方法在于从分级获得的血浆蛋白质中纯化FVIIa。

为此，EP 0 346 241描述了如何制备富含FVIIa的级分，先吸收然后再洗脱血浆蛋白质级分副产物，所述副产物含有FVII和FVIIa和其他蛋白质例如因子IX、X和II，包括PPSB预洗脱物(preeluate)(P＝凝血酶原或FII，P＝转变素原或FVII，S＝司徒因子(Stuart factor)或FX，B＝抗血友病B因子或FIX)。

类似地，EP 0 547 932描述了制备高纯度FVIIa浓缩物的方法，所述浓缩物基本不含维生素K依赖性因子和FVII。

用于从血浆中获得FVII/VIIa的这类方法的主要缺点之一是它们仅能够获得小量的产物。另一方面，一个主要的缺点是获得的产物的敏感性，所述产物全身性地提供截短的形式，因此活性较小并且更可能引起不想要的副作用。另外，从捐血者收集的血浆的可用度仍然有限。

为此，编码人因子VII的DNA早在80年代就被分离(Hagen等(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Apr 83(8)：2412-6)，并且相应的蛋白质被表达进BHK哺乳动物细胞(幼仓鼠肾)中(文件EP 0 200 421)。申请人提交的法国申请FR 06 04872也描述了在转基因动物中生产FVIIa。

这些生产方法能够获得免受可能的病毒或其他病原体污染的安全的蛋白质。这类方法能够获得下述蛋白质，所述蛋白质的一级序列与人一级序列相同。

重组人FVIIa的商业制剂目前可在商品名(NovoNordisk^TM)下获得。达到和维持想要的治疗或预防效果需要相对高的剂量以及频繁的静脉内施用。因此，这类治疗对患者而言仍然是限制性的，并且非常昂贵。

另外，已经显示FVII/VIIa是下述蛋白质，其对蛋白酶切割灵敏，导致形成没有任何凝固活性的大量分解产物(非典型性切割)。非典型性切割可发生在制备方法的多个步骤中，也可以发生在FVII/VIIa的储存期间。已观察了得自血浆的FVII/VIIa的分解产物和使用基因重组步骤产生的FVII/VIIa的分解产物。非典型性切割可在FVII被活化为FVIIa之前涉及，例如在FVII的生产和纯化期间涉及，在这样的活化步骤期间涉及，或者在活化产物(FVIIa)的纯化和/或储存期间涉及。

欧洲专利EP 0 370 036涉及在与FVII/VIIa非典型性切割相关的赖氨酸、精氨酸、异亮氨酸和/或酪氨酸残基上被修饰的FVII/VIIa，从而减少FVII/VIIa的非典型性切割，从而获得更稳定的FVII/VIIa。然而，该专利仅部分解决了获得更稳定的FVII/VIIa的困难，因为其未着眼于非典型性切割相关氨基酸的修饰所造成的有问题的FVII/VIIa构象改变。该专利既未描述也未建议获得下述FVII/VIIa的方式，所述FVII/VIIa会在非典型性切割位点水平上被修饰，并且其构象应当不受氨基酸序列修饰的影响或受很小的影响。

尽管存在关于经修饰的人FVII/VIIa、特别是在非典型性切割位点水平上经修饰的FVII/VIIa的文件，但是仍然非常需要具有改进的特性的、新的人FVII/VIIa。

发明概述