[发明专利]导致免疫球蛋白生产改善的重链突变体

说明书

本申请描述了对哺乳动物细胞中免疫球蛋白的生产有用的方法和核 酸。

发明背景

生产重组多肽的表达系统是众所周知的，并在本领域现有技术的文献 中有报道。为了生产用于药物用途的多肽，使用哺乳动物细胞例如CHO 细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、细胞，等等。编码多肽的核酸例如在质粒中被引入细胞中，例如，表达质 粒。表达质粒的基本元件是原核质粒繁殖单元，如对于大肠杆菌，其包括 复制起点和选择标记，真核选择标记，以及一个或多个用于目的核酸表达 的表达盒，其中每一个包括启动子、结构基因和包括聚腺苷酸化信号的转 录终止子。对于在哺乳动物细胞中的瞬时表达，可以包括哺乳动物复制起 点，如SV40 Ori或OriP。作为启动子可以选择组成型启动子或诱导型启 动子。对于优化的转录，可以在5′非编码区中包含Kozak序列。对于mRNA 加工，还以包含多腺苷酸化信号。

蛋白质和特别是免疫球蛋白，在今天的医疗产品中发挥了重要作用。 对于人类应用，每一药物物质必须满足不同的标准。为了确保用于人类的 生物制药因子的安全，必须特别去除会造成严重危害的物质。

mRNA剪接受剪接供体位点与剪接受体位点的组合调控，这两个位点 分别位于内含子的5′末端和3′末端。根据Watson等(Watson等 (编)，Recombinant DNA：A Short course，Scientific American Books， distributed byW.H.Freeman and Company，New York，New York，U SA (1983))是5′剪接供体位点ag|gtragt(外显子|内含子)和3′剪接受体位点 (y)_nNcag|g(内含子|外显子)的共有序列(r＝嘌呤碱基；y＝嘧啶碱基；n＝ 整数；N＝任何自然碱基)。

1980年发表了第一篇论述分泌型和膜结合型免疫球蛋白起源的文章。 重链前体mRNA的选择性剪接导致分泌型(slg)和膜结合型(mlg)同种 型的形成。在mlg同种型中，编码分泌型的C-末端区域的外显子中的剪接 供体位点(即，分别C_H3或C_H4结构域)和位于其下游一段距离处的剪接 受体位点被用于连接恒定区和编码跨膜区的下游外显子。

在WO 2002/016944中报道了一种制备合成的核酸分子的方法，当其 在特定宿主细胞中表达时具有减少的不适当或不期望的转录特征。WO 2006/042158中报道了经过修饰从而增强重组蛋白表达和/或减少或消除错 误剪接和/或内含子通读副产物的核酸分子。

因此，存在对于具有减少的副产物的免疫球蛋白的重组生产方法的需 要。

发明简述

本发明第一个方面包括编码IgA或IgG类免疫球蛋白C_H3-结构域的 C-末端部分，或编码IgE或IgM类免疫球蛋白CH4-结构域的C-末端部分 氨基酸序列的核酸，其中包含在C_H3-或C_H4-结构域的C-末端部分的主要 氨基酸序列中所包含的甘氨酸-赖氨酸二肽，由核酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、 或核酸gggaaa、或核酸ggaaag、或核酸ggcaag、或核酸gggaag编码。

在一个实施方案中，根据发明的核酸编码的氨基酸序列选自于SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7或8的氨基酸序列。在另一个实施方案中编码甘氨 酸-赖氨酸二肽的核酸前面是核苷酸g或a。在另一个实施方案中编码甘氨 酸-赖氨酸二肽的核酸是核酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、或核酸 gggaaa。

本发明的第二方面是包含根据发明核酸的质粒，本发明的第三方面是 包含根据本发明的核酸的细胞。

本发明的另一个方面是具有SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、 23、30、或31的核苷酸序列的核酸。

本发明的第五方面是在哺乳动物细胞中生产免疫球蛋白的方法，包括 下列步骤：

a)用编码免疫球蛋白重链的核酸转染哺乳动物细胞，该免疫球蛋白重 链包含SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、30、或31的核酸，其 编码免疫球蛋白重链的C-末端部分，

b)在适合免疫球蛋白表达的条件下培养转染的哺乳动物细胞，

c)从培养物或细胞再生免疫球蛋白。