[发明专利]扩增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及扩增存在于生物学试样中的甲基化核酸或非甲基化核 酸的方法。进而，涉及包含该扩增方法的方法，该方法检测生物学试样 中可能含有的目标基因和/或基因位点中的甲基化和/或非甲基化。

本申请基于作为参照而援引于此的日本专利申请特愿2007-153086 号请求优先权。

背景技术

在哺乳类中，在存在于基因组DNA序列中的5’-CG-3’DNA部分 (以下，称为CpG部位，或简单称之为CpG)中，已知位于该鸟嘌呤 (G)的5’侧的胞嘧啶(C)被甲基化的现象。CpG的甲基化修饰被认 为会对基因表达产生影响。特别是在富含CpG的区域(CpG岛)存在 于基因的启动子区域内时，CpG被认为会对基因表达产生重要影响。

通常，染色体中的多数CpG岛因甲基化而被保护。但是，由于某 些原因，如果存在于启动子区域的CpG岛被甲基化，则该基因的转录 受到抑制。例如，在人体内的抑癌基因中，发生存在于其启动子区域的 CpG岛的异常甲基化，该抑癌基因的转录被钝化时，细胞增殖的控制 变得无效，从而导致癌等细胞增殖性疾病发生。

另一方面，在CpG岛以外的区域中，通常CpG中的胞嘧啶被甲基 化。但是，有报道称，在癌和瘤中，通常被甲基化的CpG的胞嘧啶被 非甲基化。

随着近年来的分子生物学方法的发展，通过检测DNA的有无甲基 化来对癌、肿瘤的早期发现和治疗进行监控逐渐成为可能。例如，在日 本特表2000-511776号公报(专利文献1)、国际公开第02/38801A1号 公开文本(专利文献2)和Xiong Z，Laird PW.Nucleic Acids Res.1997 jun 15；25(12)：2532-4(非专利文献1)中，公开了为了迅速检测出 含CpG核酸中的甲基化，利用PCR法，诊断癌等的方法。对于这些方 法，重点置于特异性地检测出甲基化DNA方面。

进而，具体来说，公开有：由各种体液、组织或细胞系制备核酸试 样，利用重亚硫酸盐等进行将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的修饰，然 后，(1)通过能够区分非甲基化DNA和甲基化DNA的特异性引物用 PCR法(Methylation-Specific-PCR：MSP法)进行扩增，检测出甲基 化DNA的方法(专利文献1)；以及(2)通过不区分非甲基化DNA和 甲基化DNA的非特异性引物用PCR法进行扩增，用识别该PCR扩增 产物内部碱基序列的不同的限制酶进行处理，从而检测出甲基化DNA 的有无和/或比例的方法(Combined Bisulfite RestrictionAnalysis： COBRA法)(非专利文献1)。通过采用这些方法检测出特定的基因碱 基序列中的甲基化DNA的存在，能够对癌、肿瘤的早期发现和治疗进 行监控。

另外，公开了以高灵敏度检测出甲基化DNA和/或非甲基化DNA 的方法(日本特开2007-74950号公报(专利文献3))。公开了在PCR 扩增工序之后，用核酸外切酶处理已扩增的双链DNA片段，得到单链 DNA片段，通过DNA微阵列进行检测的方法。

对于MSP法、COBRA法，核酸试样(DNA试样)并不是来自组 织或细胞系、而是由各种体液而得的试样时，含有DNA量为微量，因 此成为对象的DNA不被扩增的情况很多。

一般地说，已知PCR法本身的灵敏度(通过PCR法得到扩增产物 的概率)和特异性(仅扩增目标基因区域的概率)取决于引物的碱基序 列和PCR扩增反应的条件。为了提高PCR的灵敏度，有必要放宽PCR 扩增工序的条件，这时PCR的特异性减小。

对于MSP法，使用对非甲基化DNA和甲基化DNA分别具有特异 性序列的引物进行扩增工序。在模板DNA量少时或纯化度差时，例如 以各种体液为样本时，必须放宽扩增工序的条件，而导致特异性减小。 因此，不知道检测出的扩增产物是否真的仅由非甲基化DNA或甲基化 DNA扩增而得，成为问题。另外，由于对非甲基化DNA的特异性引物 和对甲基化DNA的特异性引物的序列大为不同(例如，非甲基化DNA 用的引物多含A和T，甲基化DNA用的引物多含C和G)，而导致非 甲基化DNA和甲基化DNA的扩增灵敏度、特异性不同。进而，由于仅 以PCR产物的有无来判断有无非甲基化和甲基化，因此无法确认扩增 工序自身的错误。

对于COBRA法，对甲基化DNA的灵敏度低成为问题。将各种体 液用于样本时，有可能无法用COBRA法检测出。