[发明专利]携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子微生物学和感染免疫领域，涉及携带结核分枝杆菌基因ESAT6和Ag85B的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，涉及该疫苗的制备方法，这种重组的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗可以用以抵抗结核分枝杆菌的感染，也具有能抵抗伤寒沙门菌感染的免疫中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是一种由结核杆菌感染引起的严重危害人类健康的传染病。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球有近1/3的人感染结核杆菌，每年有300万人死于结核病，每年新发病人数达800～1000万。卡介苗(BCG)是目前唯一的结核预防性疫苗，但其对成人结核病的预防效果不稳定，保护效果从0％～80％不等，而且会干扰对结核病的诊断。因此寻找一种安全、有效、廉价且操作简便的预防结核病的新型疫苗成为当务之急。

在结核分支杆菌中，抗原85(antigen 85，Ag85)复合体为优势的分泌蛋白及保护性抗原，包括Ag85A、Ag85B和Ag85C三种蛋白成分。Ag85B含量最大，是一种能诱导明显Th1型免疫反应的免疫原性蛋白，早期分泌性的6-kD的蛋白(earlysecreted antigenic target 6-kDa antigen，ESAT6)是结核感染机体早期分泌的一种同样可以诱导明显Th1型免疫应答的优势抗原，可以诱导T细胞发生明显细胞免疫应答。

而卡介苗(BCG)是目前唯一预防结核分枝杆菌感染的疫苗，但其缺失ESAT6基因，而ESAT6是一种保护性抗原。因而有必要构建具有ESAT6等保护性疫苗以弥补BCG疫苗的不足。

而减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium SL7207是细胞内侵袭性细菌，可以通过肠道及上呼吸道途径感染，侵入粘膜相关淋巴组织(MALT)，被MALT内的专职抗原递呈细胞(APC)吞噬，并在其中增殖。减毒鼠伤寒沙门氏菌与机体相互作用可产生特异性的免疫应答，诱导IgG及肠sIgA的生成，并产生特异性细胞免疫，由于其能靶向感染APC，因而是一种很好的疫苗备选载体，从粘膜免疫方面进一步提高机体对呼吸道病原微生物如结核等感染的防御能力。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗Salmonella typhimuriumSL7207(pVAX-1-Ag85B)以及Salmonella typhimuriumSL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)，疫苗可以稳定表达结核分支杆菌的优势抗原。该减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗制备方便，经口服途径免疫后，可以明显增强小鼠的细胞免疫、体液免疫以及粘膜免疫应答，全面提高机体的抗结核分支杆菌的免疫力，它们产生的黏膜和血清SIgA水平强于BCG和DNA疫苗。并且Salmonellatyphimurium SL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)免疫保护能力大于DNA疫苗或Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-Ag85B)；联合使用Salmonella typhimuriumSL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)和BCG的免疫保护作用最强，大于单独BCG的免疫保护作用。

本发明的另个一目的是在于提供了一种制备携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗的方法，该方法较简便易行，且所制备的疫苗可以稳定的表达结核分支杆菌蛋白。

本发明的再一个目的是在于提供了一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗在制备治疗或预防结核分枝杆菌的感染药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明选用减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimuriumSL7207菌株做为载体，与其他伤寒沙门氏菌株相比，安全性较高。

本发明的目的基因是结核分支杆菌基因Ag85B以及ESAT6，二者在结核感染的过程中发挥重要的作用，可以明显诱导Th1型免疫应答，是制备结核分支杆菌疫苗的首选抗原。

本发明利用同源重组的方法将结核分支杆菌基因插入到真核表达载体质粒中，然后将构建成功的真核表达质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌中使其稳定表达结核分支杆菌抗原，刺激机体产生有效的免疫应答。

本发明采用以下技术方案：