[发明专利]梅、杏及杏梅的PCR快速鉴定区分方法

说明书

一、技术领域

本发明公开了梅、杏及杏梅的一次PCR快速鉴定区分方法，属于生物技术领域，利用特异引物快速鉴定区分梅、杏及杏梅的分子水平辅助鉴别方法，用于梅、杏及杏梅在分子水平上的明确分类及种质资源的筛选与品种鉴定。 

二、背景技术

梅(prunus mume)，原产中国，已有几千年的栽培历史，根据不同的用途可分为花梅和果梅。其中，果梅则是南方果树的代表树种之一，花梅则是我国重要的花卉植物；杏(Prunus arminiaca)是中国栽培历史最久的果树之一，在我国北方也有大面积的栽培。梅、杏都为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(Armeniaca Mill.)植物. 

由于梅、杏的地理分布、亲缘关系以及某些品种的开花物候期重叠现象的存在等因素的影响，两者存在着自然杂交的现象，又或者通过人工杂交等辅助手段培育出二者的杂交种—杏梅。有研究报道梅与杏(Prunus arminiaca)、紫杏(P.dasycarpa)、东北杏(P.mandshurica)、和山杏(P.sibirica)产生能育的F1杂种(Boonprakob U，1990)的报道。 

川上繁(1951)，吉田雅夫(1971)调查了日本果梅的所有品种，并以托叶、茸毛、节部内瘤等实用的形态为基础，判定其杂种程度，分类如下：纯梅，杏性梅，中间系，梅性杏，纯杏(中国果树志·梅卷)。虽然在地理分布以及形态学等生理指标(如开花早晚等)常常作为区分出梅、杏的标准，但现实中，很多中间类型与梅或者杏、甚至纯梅与纯杏间往往很难根据植物学性状进行正确的区分。对于杏梅这个杂交种来说，无论是在形态特征上还是生理生化水平上都介于梅、杏之间，分别具有梅、杏的特征，使梅、杏的具体分类产生了混淆，目前尚未有一种有效的方法对三个种进行明确的鉴定分类。 

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是扩增片段长度多态性，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。AFLP扩增可在不同品种间形成特定的DNA谱带指纹。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，根据这些片段进行多态性或其它分析。本实验通过AFLP对梅与杏不同品种进行多态性分析，并选择梅与杏不同的特异性公共片段进行回收进一步克隆测序。 

通过对大量所克隆片段的序列进行分析，发现了大部分序列相同但长度有异的梅与杏的特异性序列。杏与梅的序列区别在于中间插入了一段68bp的片段。根据所克隆的序列设计合成特异性引物，对更大量梅、杏、杏梅品种进行PCR扩增，再通过凝胶检测等一系列技术，发现这一对引物能够有效地在DNA分子水平上鉴定区分梅(prunusmume)、杏(apricot)及其杂交种(hybrid)杏梅(Armeniaca mume Sieb.var.bungo Makino)，为三者的种质资源筛选、品种鉴定提供了可靠的快速鉴定技术。 

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是：根据梅与杏的扩增片段长度多态性(AFLP)的公共片段开发两种树种的特异的序列，并根据序列设计引物，达到能够在分子水平上快速鉴定区分梅、杏及两者杂交种杏梅，不仅为三者的明确分类提供了可靠的方法，也为种质资源的搜集与筛选提供了理论依据。本技术的优势是利用一对引物通过一种PCR反应体系即可达到区分杏、梅以及杏梅的目的。 

技术方案本发明的实施方案如下： 

一种用特异性引物区分梅、杏的分子标记辅助鉴别方法，其特征在于： 

用标记引物2MMF/2MMR 

左端引物序列：AGGACTCAAGATCAGAATCATATTATAA 

右端引物序列：TTTAGTCCTCAACTTTGGAT 

扩增不同地区的梅(包括果梅和花梅)、杏及杏梅的基因组DNA，如果能够分别扩增出片段大小321bp的为梅，扩增出片段大小387bp的为杏，同时扩增出片段大小321bp和387bp的为杂交种杏梅。 

有益效果 

本发明获得了能够快速鉴定区分梅，杏，杏梅的分子辅助鉴别方法，其优点是： 

(1)技术稳定。本研究以梅，杏，杏梅的基因组DNA为鉴定材料，DNA遗传稳定，与普通生理生化指标区分方法不同，不受年份，环境条件的影响。