[发明专利]一种EV-71病毒毒种、人用灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于人类预防医学的技术领域。更具体地说，本发明涉及病毒毒种及其制备方法。同时，本发明还涉及用所述毒种制成的人用灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

EV-71(肠道病毒71型)感染是手足口病的主要形式之一。EV-71属于肠道病毒家族，为小RNA病毒，具有典型的二十面体结构，无包膜，通常通过肠道排泄物→口传播，在一定情况下，也可经呼吸道传播。该病毒所导致的感染通常表现为手足口出现特征性的疱疹，并伴有一定程度的发热感冒症状。重症时可以引起神经系统、呼吸系统的病变，在发病人群中具有一定的死亡率。目前，已知该病在全世界范围内存在。上世纪90年代以前，在发达国家由于公共卫生条件的改善，该病毒感染已几乎绝迹。但90年代以后，该病毒在全球各地区的发病率渐有上升。同时，由于该病毒的高传播率和其感染的重症病人可出现严重的神经系统及呼吸系统症状，因而它同时受到了作为生物恐怖因子的相应关注。在上世纪90年代后期和二十一世纪初始，该病毒感染在我国台湾地区和英国曾出现大范围的流行，并导致了一定的感染死亡率，从而受到了人们的进一步关注。2008年，我国安徽省阜阳地区亦出现了较大规模的流行，而且感染者主要出现在婴幼儿，因此引起了社会各界的严重关切。对此，我国卫生部自2008年5月起，将该疾病正式列入法定报告的传染病种类之中。

根据现有分子流行病学的分析表明，EV-71病毒共有7个血清型(A、O、C、Asia I、South African Territories 1、2、3)，每个血清型中又有多个亚型，但在免疫原性方面，各血清型均有较大程度的交叉。现有的资料表 明，在我国多数地区的优势血清型为C型，优势流行亚型为C4亚型。但迄今为止，尽管该病毒感染在我国各地区均已引起较多的发病，但仍无有效的特异性疫苗应用。因此，在强调提高我国人口健康质量的前提下，EV-71疫苗的研究显得更为迫切与重要。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种安全有效的人用EV-71灭活疫苗及其制备方法。同时，本发明还提供所述疫苗的毒种及其制备方法。

本发明技术方案的提出是基于下述思路：EV-71作为肠道病毒成员，其疫苗的研制具有多种类似的例子可循，主要的疫苗可能形式包括有减毒活疫苗以及灭活疫苗，但前者存在着回复突变、毒力返祖，以及其它尚未知晓的疫苗相关疾病可能性。因此，作为一种具有安全性和应急意义的疫苗，灭活疫苗具有相对的优势。但其要求该疫苗毒株具有较强的免疫原性和较好的生长复制能力。同时，作为新型的预防性疫苗，使用合适的细胞基质可提升该疫苗的质量品质。目前已广泛使用于灭活疫苗生产制备的传代细胞基质主要包括两类：一是来自非洲绿猴肾的Vero细胞，二是来自人胚肺的二倍体成纤维细胞。前者对病毒疫苗具有较快的生产增殖能力，但因属于异源物种细胞，因此在疫苗的纯化制备方面具有较高的质量要求。后者尽管在病毒疫苗的生长复制支持能力方面相对较Vero细胞稍差，但其作为来源于人的细胞，具有更好的安全性。在上述前提下，本发明所描述的EV-71为来源于EV-71感染重症病人的分离株，具有较强的组织培养生长能力，同时在动物体内表现了较好的免疫原性。而且，已适应生长于人源二倍体细胞株，在保证具有较高安全性的同时，亦具有较好的增殖复制能力。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

A.本发明提供了一种EV-71灭活疫苗的毒种，该毒种的分类命名为肠道病毒71型，保藏编号为CGMCC№.2701。其包括原始种子、主种子和工作种 子三个库；具有序列表所示的结构和下述特征：

1.该毒种经混悬吸附方法接种KMB-17细胞后3-4天即可出现典型细胞病变现象；

2.该毒种在KMB-17细胞上的生长动力曲线表明，当该病毒以混悬形式接种于KMB-17细胞时，在八小时内接种细胞即可出现初步的典型病变，同时，该病变可在24-48小时内出现高峰，对此时的病毒收获液进行滴度检测表明，其滴度通常为7.5±0.3Log CCID₅₀；

3.该毒种按原倍及1:10稀释度，以0.25ml/只乳鼠的剂量接种3-4日龄乳鼠时，可引起乳鼠在3-5天内出现典型的四肢迟缓型麻痹症状，但此致麻痹作用可由该毒种免疫动物(小鼠或其它实验动物)后所得到的特异性抗血清中和后消除；