[发明专利]聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽，特别涉及一种聚乙二醇类修饰的中和内毒素多肽，还涉及该修饰多肽的制备方法和应用。

背景技术

脓毒症(sepsis)是革兰氏阴性(G-)菌感染所致的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是严重创伤、大面积烧伤等临床急危重患者的严重并发症之一，也是诱发脓毒性休克(septic shock)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要原因。根据美国疾病控制中心的统计调查结果，美国每年大约有75万人感染脓毒症，超过21万人因此而丧生。己经证明，存在于G^-菌细胞外膜上的内毒素(lipopolysaccha-rides，LPS)在SIRS中起着启动子的作用，进入血中的LPS能诱导多种炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的释放，并激活凝血、纤溶、补体系统，通过这些因子直接或间接导致微循环障碍、器官功能衰竭。

近年来虽然大量广谱、高效抗生素的应用，为临床治疗感染性疾病提供了有力武器，但并没有从根本上改变脓毒症患者高死亡率的现状，原因在于抗生素虽然能抑制和杀灭细菌，但却不能拮抗内毒素的作用，而且可能在杀灭细菌同时引起内毒素的释放，从而加重炎症反应。国际上关于脓毒症的防治研究已有数十年历史，直接针对LPS或针对由LPS介导的各种炎症因子的调控措施不断提出，主要有抗类脂A抗体、各种抗炎症因子抗体及受体拮抗剂等，但至今尚无一种安全有效的药物应用于临床。因此，寻找既能杀菌又能中和LPS的药物是许多医学工作者研究的目标。

杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)是一种存在于人及哺乳动物中性粒细胞(PMN)嗜天青颗粒中的带正电荷的蛋白质，由456个氨基酸组成，具有特异性杀灭G^-菌及中和LPS的活性。BPI经弹性蛋白酶有限水解后生成两个主要片段，其中N端第1～199位氨基酸的25kDa片段(BPI₂₅)具有BPI的全部生物学活性。国外基于N端靶点设计的重组BPI₂₃(rBPI₂₃)及其突变体rBPI₂₁的开发研究己进入扩大的III期临床试验，初步结果证明，rBPI₂₃和rBPI₂₁对严重G-菌感染具有显著的疗效，但其生物半衰期短，存在需连续给药、用药量大、成本高等问题，难以推广应用。

Little等研究发现，rBPI₂₃的杀菌、中和LPS及与肝素结合活性分别对应N端三个分离的功能区域：第17～45位、第65～99位、第142～169位氨基酸(Little RG，et al.J.Bio.Chem.，1994，269(3)：1865～1872)。基于此发现，许多医学工作者开始进行具有杀菌和中和LPS活性的小分子多肽的研究，以利用小分子多肽合成可靠、成本低、活性强的优点来克服rBPI₂₃和rBPI₂₁的缺陷。

中国专利ZL 94191894.7和ZL 94194835.8公开了来自BPI的功能区的生物活性肽的氨基酸序列或其亚序列，以及这些序列的变异体，它们具有BPI的至少一种生物学活性，如肝素结合、肝素中和、LPS结合、LPS中和或杀菌活性。

中国专利ZL 01104591.4根据对BPI N端三个loop区的空间构象分析及物理性质分析，利用计算机辅助药物设计技术，设计并合成了一系列小分子模拟肽，通过生物活性筛选，得到66个杀菌/中和LPS模拟肽(bactericidal/neutralizing -endotoxin peptide，BNEP)，体内外试验显示：BNEPs对E.coliβ-HI、E.coli J5、E.coli V517、MSSA25923、PSPNC49619和PA103等细菌有不同程度的杀菌活性；可明显降低血清中TNF-α高峰浓度，具有延长脓毒症动物生存时间、提高动物生存率的作用；具有中和LPS的能力，对LPS诱导的人单核细胞TNF-α和IL-6的分泌具有抑制作用；对内毒素攻击小鼠具有保护作用，对内毒素介导的大鼠TNF-α和IL-6的产生具有抑制作用，对大鼠内毒素血症具有治疗作用；可以用于治疗G^-菌感染和人内毒素血症。