[发明专利]一种肿瘤组织全抗原的制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，尤其涉及肿瘤组织全抗原的制备方法和用 途。

背景技术

目前应用肿瘤疫苗激发患者体内生成抗肿瘤的免疫力，即主动免疫治疗肿 瘤的方法有多种，包括肿瘤特异性/相关性抗原蛋白、肿瘤特异性/相关性抗原 多肽、表达肿瘤抗原的质粒、免疫基因修饰的肿瘤细胞、肿瘤抗原冲击的树突 状细胞(dendritic cells，DC)等。其中肿瘤抗原冲击的DC最目前具应用前 景的肿瘤疫苗，即树突状细胞疫苗(dendritic cell-based vaccine)。

DC疫苗是近十年发展起来的新型肿瘤治疗疫苗，主要机理是通过给肿瘤患 者免疫接种携带肿瘤抗原的DC，通过激活体内肿瘤特异性T细胞等机制，诱导 患者机体产生特异性的、持久的抗肿瘤免疫应答，清除肿瘤细胞。目前DC疫 苗已被批准进入I-III期临床试验，用于治疗淋巴瘤、骨髓瘤、肾癌、前列腺 癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤。

DC疫苗的制备通常包括三个步骤：首先制备获得患者的肿瘤抗原，其次通 过体外分离或培养的方法获得患者自身的DC，最后将肿瘤抗原体外冲击DC， DC负载肿瘤抗原后即制备成肿瘤疫苗。

肿瘤抗原有多种形式，包括：细胞性肿瘤抗原(经放射线照射灭活的肿瘤 细胞、肿瘤细胞冻融上清或肿瘤细胞冻融后膜碎片等)、肿瘤细胞的亚细胞成 分(凋亡小体、外排小体exosome、自噬小体autophage等)、肿瘤特异性/ 相关性抗原蛋白、肿瘤特异性/相关性抗原多肽、弱酸洗脱的肿瘤细胞表面的 抗原肽等。DC的制备也可以选择多种方法，例如直接从外周血分离DC、从外 周全血分离单个核细胞培养DC、经免疫磁珠分离单核细胞后培养DC、从骨髓 造血干细胞培养DC等。体外抗原冲击的方法一般选择合适的抗原剂量，加入 DC培养体系中孵育培养4-24小时，洗去未被DC摄取的游离抗原，获得肿瘤抗 原冲击的DC疫苗。

此外还可以通过肿瘤细胞mRNA转染DC制备疫苗、通过细胞融合杂交瘤技 术制备肿瘤细胞—DC融合疫苗等。

但是目前DC疫苗的临床应用仍受很多方面的限制。一方面是疫苗的免疫 原性仍不够强，另一方面是大部分患者无法获得有效的肿瘤抗原。

肿瘤特异性/相关性抗原蛋白、肿瘤特异性/相关性抗原多肽抗原性较弱， 激活免疫靶点单一，疫苗免疫原性差，且大部分类型的肿瘤目前尚无法确定有 效的肿瘤特异性/相关性抗原蛋白及抗原多肽，还进一步受HLA限制，只能被 用于特定HLA亚型的患者，因此难以广泛应用。经放射线照射灭活的肿瘤细胞、 肿瘤细胞冻融上清或肿瘤细胞冻融后膜碎片、肿瘤细胞的亚细胞成分等含有各 种肿瘤抗原的蛋白、多肽，抗原性强，DC摄取后制备的疫苗携带的肿瘤抗原靶 点全面，激发机体产生的抗肿瘤免疫力较全面，但大部分类型的肿瘤目前无法 通过体外培养的方法获得足够数量的肿瘤细胞，因此也难以获得广泛应用。更 为重要的问题是，肿瘤患者往往肿瘤复发后才行DC疫苗的免疫治疗，而此时 新鲜的肿瘤组织已经丢失，无法制备肿瘤抗原。

医院病理科都长期保留有所有患者的肿瘤组织，但经甲醛固定后石蜡包 埋，含有甲醛及石蜡，为坚硬固体，抗原变性，目前无法用于制备有效的肿瘤 抗原，因此也就无法制备DC疫苗。

因此，本领域迫切需要提供一种肿瘤抗原，它来源于经过长期保存的肿瘤 组织，但含有肿瘤全部蛋白抗原、抗原稳定；抗原冲击的疫苗，操作简便、易 于质控，疫苗活性强。

发明内容

本发明旨在提供一种肿瘤组织全抗原及其制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种肿瘤疫苗及其制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种肿瘤组织全抗原的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种肿瘤组织全抗原的制备方法，所述的方法包 括步骤：

(1)将肿瘤活检组织的福尔马林(4-10％甲醛)固定的石蜡包埋样本和有机 溶剂混合，使石蜡溶解，得到含有肿瘤组织的溶液；

(2)将含有肿瘤组织的溶液离心、得到沉淀1；

(3)将沉淀1和pH小于7的无机物水溶液混合0.5—12小时，离心除去液 体得到沉淀2；

(4)将沉淀2置于水蒸汽中进行灭活细胞浆中蛋白酶的处理10—30分钟， 得到灭活了细胞浆中蛋白酶的肿瘤组织；

(5)将步骤(4)得到的肿瘤组织进行匀浆处理，得到乳糜状液体；和