[发明专利]血清微小核糖核酸试剂盒及其在乙肝早期诊断中的应用

说明书

一技术领域

本发明属于生物技术制药技术领域，具体涉及血清/血浆微小核糖核酸在乙型肝炎的诊断、预测、疗效评价、药物活性成分的筛选、药效评价等方面的应用。

二背景技术

乙肝病毒(Hepatitis B virus：HBV)是全世界最常见的致病微生物之一。据统计，目前全世界约有4亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者。慢性乙型肝炎可能导致严重的并发症(如肝硬化和肝癌)，统计数据表明，全世界约80％的原发性肝癌与乙型肝炎病毒感染有关。流行病学调查显示，我国约有1.3亿人长期携带乙肝病毒。专家推算，我国现有慢性乙肝病人约2000多万，每年约有28万人死于与乙肝病毒感染相关的肝硬化或肝癌。目前对乙型肝炎进行临床诊断的传统生物化学及分子生物学技术方法主要包括反向被动血凝、酶联免疫吸附试验、基因诊断等，这些方法还比较繁琐和粗糙，在灵敏度、特异性、效率性、普及性、样品准备和保存方面都会存在各种缺陷或不足。由于乙肝病毒感染尚无理想的早期诊断方法，因此开发有效的乙肝检测方法是当务之急，这样才能实现乙肝患者的早诊断、早治疗。

微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖核酸的表达水平均有不同程度的下调；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生和发展之间存在着必然联系。

由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标志物，它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。

本发明人已经开展了以微小核糖核酸作为疾病标志物的相关领域的研究，例如我们发现大部分的血清微小核糖核酸来自于血清中的细胞微粒子(microparticles)。血清中的细胞膜微粒子来自人体不同的细胞(不仅是血细胞)且包含和特定细胞/组织相关的微小核糖核酸，检测血清中细胞膜微粒子内微小核糖核酸的变化就可以得到整个机体的病变情况；更重要的是细胞微粒子带有源头细胞表面特有的受体蛋白或膜脂结构，与对应的靶细胞有高亲和性，因而可以选择性地递送微小核糖核酸到靶细胞/组织，从而大大提高微小核糖核酸调控细胞功能的作用。显然，由于细胞微粒子(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)本身具有和特定组织及细胞结合的特异性，其所载微小核糖核酸也呈现较强的靶向性、稳定性及高效率，它在疾病的诊断及治疗方面有重大应用前景。另外我们还选取乙型肝炎作为研究对象，经研究发现，在正常人、乙型肝炎携带者、乙型肝炎病人之间，一些微小核糖核酸分子都存在着特异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建立起一种更敏感、更精确的早期确诊、治疗乙型肝炎的方法。

三发明内容

目前，对乙型肝炎的诊断仅仅局限于血清/血浆中的各种生化指标，还没有关于血清/血浆微小核糖核酸用于乙型肝炎诊断与治疗方面的任何报道。基于微小核糖核酸的这一发现，本发明人将研究目光锁定在血清/血浆微小核糖核酸在乙型肝炎诊断与治疗方面的重大应用前景。