[发明专利]一种蝮蛇生物活性酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学制药技术，具体地说，涉及一种蝮蛇生物活性酶的制备方法。

背景技术

蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90％至95％，其中，酶类和毒素约含二十多种。此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒有液体黄金之称，具有很好的医用价值，可制备特效药抗蛇毒血清，还可制备镇痛剂和止血剂，效果胜于吗啡、度冷丁，无成瘾性。蛇毒还可治疗瘫痪、小儿麻痹症等。近年来蛇毒又被用以治疗癌症，因为蛇毒由34种蛋白质构成的化合物，其中有一种很重要且数量较多的毒素叫溶细胞素。它是一种专门破坏细胞和细胞膜的毒素。

现在临床上应用的蛇毒精制成分有两种，一是自巴西蛇毒分离的一种促凝血成分名叫reptilase，用于防止内出血，另一种是自马来西亚蛇毒分离所得的成分名叫arvin，用于防止血栓病的形成。随着人们对蛇毒的研究，蛇毒在临床医学的应用也会更多。中国专利公开号为CN1673363A的专利申请文件公开了一种蝮蛇活肝酶及其制备工艺，通过该专利方法得到生物活性物质具有治疗肝病的用途，但是该专利申请中的制备工艺方法很难实现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种蝮蛇生物活性酶的制备方法。通过该方法制备的蝮蛇生物活性酶能够用于治疗肝纤维化疾病。

为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案是：蝮蛇生物活性酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)取蝮蛇毒干粉，用该蛇毒干粉1～5倍重量份的pH7.1～8.0的0.005～0.01mol/L缓冲液溶解，经8000～10000转高速离心30～60分钟，取上清液用阴离子交换层析柱分离，先用含0.01～0.05mol/L氯化钠的pH7.1～8.0的0.005～0.01mol/L缓冲液洗脱，再用含0.1～0.5mol/L氯化钠的pH7.1～8.0的0.005～0.01mol/L缓冲液洗脱，收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集各吸收峰的洗脱液中能水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)的部分，将收集液透析除盐，冻干成粉；

(2)将步骤(1)中获得的冻干粉，用0.01～0.05mol/L碳酸氢钠洗脱液溶解，经8000～10000转高速离心30～60分钟，取上清液用凝胶柱分离，然后用0.01～0.05mol/L碳酸氢钠洗脱液洗脱，收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集各吸收峰的洗脱液中能水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)的部分，将收集液透析除盐，冻干成粉；

(3)将步骤(2)中获得的冻干粉，用pH5.0～6.0的0.01～0.03mol/L醋酸钠缓冲液溶解，经8000～10000转高速离心30～60分钟，取上清液用羧甲基-琼脂糖凝胶Cl-6B阳离子交换柱分离，用氯化钠直线梯度方式洗脱，该氯化钠溶液的浓度从0mol/L线性递增至1mol/L，收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集活性吸收峰的洗脱液，透析除盐，冻干。

上述步骤(1)中所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液；所述的阴离子交换层析柱为二乙氨乙基交联葡聚糖A-50型或二乙氨乙基交联葡聚糖A-25型；

上述步骤(2)中所述的凝胶柱为葡聚糖凝胶G-75型或葡聚糖凝胶G-100型；

所述制备方法中透析除盐的条件为透析袋孔径为8000～10000道尔顿，将收集液装入透析袋，放入收集液20～50倍体积的蒸馏水，搅拌透析，4～8小时换一次蒸馏水，透析18～32小时。

本发明的蝮蛇生物活性酶的制备方法，工艺稳定，质量可控，在每个分离纯化步骤中均有收集活性组分的检测指标，保证了产品的质量与活性。其中制备方法步骤(1)和(2)中通过检测各吸收峰的洗脱液是否能够水解BAEE来确定合并收集液的范围。试验中可以采用本领域公知的BAEE检测方法进行，本发明提供一种BAEE的检测方法，具体如下所述：

称取BAEE27.4mg溶解于100ml pH8.0的0.05mol/L的Tris-HCl水溶液中。取上述配制的BAEE底物溶液2.9ml于1cm光程的石英比色皿中，加0.1ml待测收集液，立即混匀，于波长253nm处读数，观察5分钟内数值的变化。计算活力单位：