[发明专利]抗肿瘤转移药物高通量筛选模型

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，涉及抗肿瘤转移药物高通量筛选模型。

背景技术

组织因子(tissue factor，简称TF)，即凝血因子III，为单链跨膜糖蛋白，属于细胞因子超家族成员，是生理性止、凝血过程及多种病理性血栓形成的启动因子^[1]。TF既是凝血因子VII(FVII)在细胞表面的受体，又是FVII或FVII(a)的辅因子。当血管破损后或在病理情况下，血液暴露于能表达TF的细胞表面，受体TF即与其配体VII或VIIa形成复合物，进而同时激活凝血因子X和IX，激活的FXa和FIXa进一步激活凝血酶原(FII)，FIIa使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而完成凝血的级联反应，导致血液凝固。许多心血管疾病如动脉粥样硬化(AS)、急性冠脉综合征以及某些疾病的血栓栓塞性并发症都与TF密切相关^[2]。同时，TF的生物学作用的多样性已经得到证实，除了其在凝血过程中的作用以外，TF还承担了信号受体和其他非凝血功能，使得它在系统性炎症^[3]、败血症、动脉粥样硬化、肿瘤的血管发生及转移等疾病中都起重要作用^[4]，并且与胚胎的正常发育有关^[5]。这就使TF或TF/FVII(a)复合物成为抗凝、抗血栓及抗肿瘤药物等发现的一个很有吸引力的新靶点。因而从天然化合物中寻找TF抑制剂或其先导化合物可能会有深远的意义。

肿瘤的转移是一个多步骤、多阶段的肿瘤细胞与宿主细胞相互作用的复杂的生物学过程，与肿瘤治疗的远期效果密切相关。大致步骤是：①原发灶肿瘤细胞的增殖及游离；②肿瘤细胞浸润血管基底膜、游走至血管内；③与转移部位血管内皮细胞粘附，并穿过血管内皮细胞、游走至血管外；④转移至靶器官并增殖，形成转移灶。肿瘤的转移涉及多方面的细胞外、细胞内信号转导途径，并有多种细胞因子、生物信号分子的参与。

近年来的临床观察和体内外实验研究均证实^[6]：高表达TF的实体瘤(如直肠癌)细胞转移能力强，且由转移病灶建立的亚系表达TF的能力较母系细胞高。用TF单抗阻断TF受体功能后，可使侵袭至SCID小鼠肺部血管的肿瘤细胞数减少，肺转移灶减少。有学者将低表达和高表达TF的黑色素瘤细胞系分别注射至SCID小鼠体内，结果发现注射高表达TF细胞的小鼠有86％出现癌细胞转移，而注射低表达TF细胞的小鼠仅5％出现癌转移，且这种作用可被TF抗体取消^[7]。

经研究证实，TF可调节肿瘤血管的生成和抗血管生成之间的平衡。体内实验发现高表达TF的转染细胞和未经转染的细胞比较，高表达TF的转染细胞生长速度快，肿瘤体积大且血管丰富，低表达TF者则相反，并发现高表达TF的肿瘤细胞其有丝分裂活性增强，VEGF转录增强，具有抗血管生成作用的凝血酶敏感蛋白(TSP)转录减弱^[8]。因此，TF可能是促进肿瘤血管形成的直接诱因，而恶性肿瘤诱导血管生成是其恶性特征之一，也是肿瘤生长和转移的先决条件。

高通量药物筛选(HTS)是近十年国际药业研究发展过程中兴起的一门新兴技术，它已经被世界各大医药公司广泛用于药物先导物的筛选。通过对种类繁多的合成及天然化合物作针对各种药物靶体的筛选，从中寻找最佳的先导化合物，进而用于新型药物的开发。其特点是规模大、速度快、成本相对较低，缩短新药开发周期^[15，20]。

研究发现TF与肿瘤的生成、浸润和转移相关，但目前尚未有利用的细胞水平组织因子高通量药物筛选模型进行筛选抗肿瘤转移药物的报导。

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于筛选抗肿瘤转移药物的组织因子抑制剂高通量药物筛选模型。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，该模型的筛选方法是：

MDA-MB-435细胞接种于培养板，培养液中分别加入待筛化合物，以不加任何抑制剂为对照，共同培养适当时间后反复冰融，得细胞裂解液；

细胞裂解液加入含CaCl₂的人凝血酶原复合物溶液共同孵育，加入发色底物，于405nm测定吸光度，计算TF抑制率，抑制率大于20％的化合物为阳性化合物。