[发明专利]基因捕获载体及建立全基因组突变胚胎干细胞库的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一组捕获载体，并利用捕获载体进行全基因组的基因捕获，建立全基因组突变胚胎干细胞库的方法。

背景技术

三十年来，随着遗传技术的不断发展，采用实验室小鼠对基因功能进行深入研究得到广泛的应用，这些研究使我们对人类健康与疾病有了更深了解。然而这些生物和遗传技术发展仍然没有被充分地运用到生物和医学研究上，以取得在这些领域的突破性进展。关键问题是要提高小鼠基因功能研究规模与速度，并制定一套标准以对这些研究结果有一个标准化的解释，把那些与医学最为相关的药物靶标(基因)及时地鉴定出来。一个很容易进行规模性小鼠基因功能研究的遗传技术就是基因捕获。采用这种方法可将一个合成的DNA片段随机地插入小鼠基因组中的内源基因中以干扰基因的正常转录，从而达到敲除该基因的目的。因此，构建大规模的突变体基因文库(最好是完全失活)需要设计特殊载体，以便于筛选出由于载体嵌入所引发的突变体。同时还要求设计出载体使它们不仅仅局限于检测出那些在胚胎干细胞内表达的基因，同时也能检测出那些在胚胎干细胞内不表达的基因或胚胎致死基因的突变体。

大多情况下，一个基因捕获载体构造包括剪接受体，选择标记基因，以及其内部嵌入一个polyA信号的逆转录病毒基因组结构，这样的结构可以装配成病毒颗粒以便感染胚胎干细胞(Abuin，A.，G.M.Hansen，and B.Zambrowicz.2007.Gene trap mutagenesis.Handb ExpPharmacol：129-147)。当载体嵌入发生在转录活性区域时，标记基因开始被转录与翻译表达，而根据标记基因表达就可以筛选出突变体克隆。这种基因突变体的形成多数是由于载体内的剪接受体捕获了内源基因的剪接供体而干扰了内源基因的转录，也有一些是由于载体直接嵌入基因的外显子从而干扰了基因的转录。另有一类基因捕获载体，其选择标记基因有它自己的启动子，因此无论载体是否嵌入转录活性区域，它的选择标记基因都可以被启动转录，但转录过程中需要捕获内源基因3’末端的含polyA的外显子以保证选择标记基因的正常转录。

常规基因诱捕技术中的一个问题是无法进行基因替换(如用人类的基因替代小鼠基因)和引入基因点突变，另一个突出的缺陷就是不能诱变在胚胎发育过程中所必须的基因(可导致胚胎致死)，使得建立的细胞库并不能完全覆盖基因组中的全部基因。

发明内容

该发明拟克服常规基因诱捕技术中存在的问题，通过一组四个载体的联合使用对基因组中不同的基因进行捕获。利用这套载体大规模地建立胚胎干细胞突变体克隆，构建胚胎干细胞文库，其遗传变异是随机的，又具有一定的变异频率，可保证基因组中的任何一个基因的突变体都能在该文库中找到，尤其是成活小鼠中不存在的胚胎致死基因。该胚胎干细胞文库可获得特定突变细胞和单个突变细胞发展的细胞群，以及通过转基因技术获得非人类转基因动物。

(一)捕获载体

本发明提供了一套含有四个不同捕获载体的载体系统，联合使用可以对全基因组中的不同类型基因进行捕获，最大限度地保证所构建的文库包含一套完整基因组内的基因突变体。四个载体左右两端均各自有一个长末端重复序列(LTR)，可以启动捕获载体在细胞中的转录和将捕获载体两个LTR之间序列嵌入基因组中从而导致基因突变。其中Trp1用于捕获在细胞中转录的基因，Trp2和Trp3捕获在受体细胞中不表达基因，Trp4捕获胚胎致死基因。具体说明如下：

Trp1是用于捕获在受体细胞中转录基因的载体。该载体包含一个β-半乳糖苷酶和新霉素抗性基因融合的标记基因(βgeo)，标记基因之前的受体序列(SA)，标记基因之后的polyA信号(pA)。基因捕获载体嵌入到目标细胞基因组中的内源基因，在内源基因启动子和调控因子的作用下进行转录，选择标记基因上游的剪接受体将捕获内源基因外显子的剪接供体，形成一个由部分内源基因和选择标记基因相融合转录本，选择标记基因被激活并表达，利用融合蛋白βgeo对捕获的基因进行表达分析(图2)。