[发明专利]导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种通过玉米花丝切面经花粉管渗入胚囊定向导入抗旱植物摩擦禾或高粱或谷子外源总DNA培育新型抗旱性玉米自交系的方法。

背景技术：

我国1978年首先提出用植物总DNA通过花粉管通道对作物进行DNA片断的转化，并首先用放射自显影的方法在棉花胚珠的花粉管通道和胚囊中看到带有同位素标记的DNA，证明转化时注入的DNA进入了胚囊。随后国内许多育种单位开展了通过花粉管通道将DNA导入植物的研究。

通过花粉管通道进行外源DNA导入的技术已越来越多地被用于作物育种，并得到了迅速发展，取得了令人瞩目的成果。已经开展DNA直接导入育种的作物包括主要的大田粮油和经济作物，并扩大到蔬菜、树木等，所采用的供体有品种间的、也有广泛的种、属、科间等的远缘供体，有的甚至用动物DNA。

利用花粉管通道向植物导入外源DNA(包括天然DNA大分子，天然DNA片段和经人工改造构建的重组DNA)，现有的方法一般分为注射法和滴加法。注射法是在授粉后一定时间，即在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将外源DNA用注射器注入具有花粉管通道的组织上或组织内部，使DNA进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。滴加法也是在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将花柱切断，将外源DNA滴加在切面上，或者不切断花柱，将外源DNA直接滴加在柱头上，使DNA沿花粉管通道涌入胚囊，进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。

用注射法和滴加法将外源天然DNA导入棉花的方法。受体材料是棉株上已经自交受精的隔日幼铃。操作方法是，在去除花冠、雄蕊、柱头和花柱后，用微量进样器从幼铃顶端向下插入胎座，将外源DNA注入(注射法)。或者，直接在花柱的切口处滴加外源DNA(滴加法)。其中注射法的结实率为29.3-32.7％，对照结实率91-100％)，滴加法的结实率为31-33％(相对结实率接近100％)。通过花粉管通道转化植物的方法具有操作简单，对仪器设备要求低的优点，适宜于所有有性繁殖的被子植物。因为有性繁殖的被子植物，其胚珠是由子房包被的，花粉管通过花柱进入子房包被的胚囊中。而且这种转化方法能够直接得到转化种子，不需要组织培养再生过程，适用的植物种类(品种)广泛。

发明内容：

本发明的目的是提供一种改进的将外源抗旱物种总DNA通过玉米花粉管通道导入玉米胚囊的操作方法。该方法转化玉米培育抗旱种质目的性强、水平高，导入后的结实率高，并具有较高的稳定性(可重复性)。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，用十六烷基三乙基溴化铵法提取摩擦禾或高粱或谷子外源总DNA，在玉米人工授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝，并以手术刀将中间的花丝割去，使雌穗包叶与花丝形成1个穴状空间，将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内，使DNA溶液与花丝的横切面充分接触。

所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，所述的将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内的位置是由苞叶与花丝所形成的穴状空间，空间一般直径小于1.5cm。

所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，所述的沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝是在人工授粉后6-18小时内进行的。

所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内后，雌穗马上套上硫酸纸袋以防止DNA溶液被风吹干以及挥发。

所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液是溶解于10m mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10m mol/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为100-500μg/ml。

所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，外源DNA溶液在穴状空间内重复滴用1次，间隔时间为5-10分钟，所述的剪除花丝与滴加摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液应在充分降雨或灌溉后24小时进行的。

这个技术方案有以下有益效果：

1.在常规育种中，玉米与抗旱的摩擦禾(高粱或谷子)无法进行杂交来转移抗旱特性，本发明则通过抗旱物种总DNA滴加在授粉玉米花粉管上的办法，将摩擦禾(高粱或谷子)抗旱的遗传特性转移到现有玉米自交系中，创造性地培育玉米抗旱新种质，转化效率高。为玉米抗旱育种提供了一个可行的思路与方法。